Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak od tri slajda odjednom.Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće da se krećete kroz tri slajda odjednom ili koristite dugmad klizača na kraju da se krećete kroz tri slajda odjednom.
Sa razvojem novih ultra-mekih materijala za medicinske uređaje i biomedicinske primjene, sveobuhvatna karakterizacija njihovih fizičkih i mehaničkih svojstava je i važna i izazovna.Tehnika nanoindentacije modificirane mikroskopije atomske sile (AFM) primijenjena je za karakterizaciju ekstremno niskog modula površine novog lehfilcon A biomimetičkog silikon hidrogel kontaktnog sočiva obloženog slojem razgranate polimerne strukture četkice.Ova metoda omogućava precizno određivanje kontaktnih tačaka bez efekata viskoznog istiskivanja kada se približavaju razgranatim polimerima.Osim toga, omogućava određivanje mehaničkih karakteristika pojedinih elemenata četkice bez efekta poroelastičnosti.To se postiže odabirom AFM sonde s dizajnom (veličina vrha, geometrija i brzina opruge) koji je posebno pogodan za mjerenje svojstava mekih materijala i bioloških uzoraka.Ova metoda poboljšava osjetljivost i tačnost za precizno mjerenje veoma mekog materijala lehfilcon A, koji ima izuzetno nizak modul elastičnosti na površini (do 2 kPa) i izuzetno visoku elastičnost u unutrašnjem (skoro 100%) vodenom okruženju. .Rezultati površinske studije ne samo da su otkrili ultra meke površinske osobine lehfilcon A sočiva, već su također pokazali da je modul razgranatih polimernih četkica uporediv s modulom silicijum-vodikove podloge.Ova tehnika karakterizacije površine može se primijeniti na druge ultra-meke materijale i medicinske uređaje.
Mehanička svojstva materijala dizajniranih za direktan kontakt sa živim tkivom često su određena biološkim okruženjem.Savršeno podudaranje ovih svojstava materijala pomaže u postizanju željenih kliničkih karakteristika materijala bez izazivanja neželjenih ćelijskih odgovora1,2,3.Za rasute homogene materijale, karakterizacija mehaničkih svojstava je relativno laka zbog dostupnosti standardnih procedura i metoda ispitivanja (npr. mikroindentacija4,5,6).Međutim, za ultra-meke materijale kao što su gelovi, hidrogelovi, biopolimeri, žive ćelije, itd., ove metode ispitivanja općenito nisu primjenjive zbog ograničenja rezolucije mjerenja i nehomogenosti nekih materijala7.Tijekom godina, tradicionalne metode udubljenja su modificirane i prilagođene za karakterizaciju širokog spektra mekih materijala, ali mnoge metode i dalje pate od ozbiljnih nedostataka koji ograničavaju njihovu upotrebu8,9,10,11,12,13.Nedostatak specijaliziranih metoda ispitivanja koje mogu precizno i ​​pouzdano okarakterizirati mehanička svojstva supermekih materijala i površinskih slojeva ozbiljno ograničava njihovu upotrebu u različitim primjenama.
U našem prethodnom radu predstavili smo lehfilcon A (CL) kontaktna sočiva, mekani heterogeni materijal sa svim ultra mekim površinskim svojstvima proizašlim iz potencijalno biomimetičkih dizajna inspiriranih površinom rožnice oka.Ovaj biomaterijal je razvijen cijepljenjem razgranatog, umreženog polimernog sloja poli(2-metakriloiloksietilfosforilholina (MPC)) (PMPC) na silikon hidrogel (SiHy) 15 dizajniran za medicinske uređaje na bazi.Ovaj proces cijepljenja stvara sloj na površini koji se sastoji od vrlo meke i visoko elastične razgranate polimerne strukture četke.Naš prethodni rad je potvrdio da biomimetička struktura lehfilcon A CL pruža superiorna svojstva površine kao što su poboljšana prevencija vlaženja i prljanja, povećano podmazivanje i smanjena ćelijska i bakterijska adhezija15,16.Osim toga, upotreba i razvoj ovog biomimetičkog materijala također sugerira daljnje širenje na druge biomedicinske uređaje.Stoga je kritično okarakterizirati površinska svojstva ovog ultra-mekog materijala i razumjeti njegovu mehaničku interakciju s okom kako bi se stvorila sveobuhvatna baza znanja koja će podržati budući razvoj i primjenu.Većina komercijalno dostupnih SiHy kontaktnih leća sastavljena je od homogene mješavine hidrofilnih i hidrofobnih polimera koji formiraju jednoliku strukturu materijala17.Provedeno je nekoliko studija kako bi se ispitala njihova mehanička svojstva korištenjem tradicionalnih metoda ispitivanja kompresije, zatezanja i mikroudubljenja18,19,20,21.Međutim, novi biomimetički dizajn lehfilcon A CL čini ga jedinstvenim heterogenim materijalom u kojem se mehanička svojstva razgranatih polimernih struktura četkica značajno razlikuju od onih SiHy baznog supstrata.Stoga je vrlo teško precizno kvantificirati ova svojstva korištenjem konvencionalnih metoda i metoda udubljenja.Obećavajuća metoda koristi metodu testiranja nanoindentacije implementiranu u mikroskopiji atomske sile (AFM), metodu koja je korištena za određivanje mehaničkih svojstava mekih viskoelastičnih materijala kao što su biološke ćelije i tkiva, kao i meki polimeri22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.U AFM nanoindentaciji, osnove testiranja nanoindentacije su kombinovane sa najnovijim dostignućima u AFM tehnologiji kako bi se obezbedila povećana osetljivost merenja i testiranje širokog spektra inherentno supermekih materijala31,32,33,34,35,36.Osim toga, tehnologija nudi i druge važne prednosti korištenjem različitih geometrija.indentera i sonde te mogućnost ispitivanja u raznim tekućim medijima.
AFM nanoindentacija se uslovno može podeliti na tri glavne komponente: (1) oprema (senzori, detektori, sonde, itd.);(2) mjerne parametre (kao što su sila, pomak, brzina, veličina rampe, itd.);(3) Obrada podataka (korekcija osnovne linije, procjena dodirne tačke, uklapanje podataka, modeliranje, itd.).Značajan problem s ovom metodom je što nekoliko studija u literaturi koje koriste AFM nanoindentaciju izvještavaju o vrlo različitim kvantitativnim rezultatima za isti uzorak/ćeliju/tip materijala37,38,39,40,41.Na primjer, Lekka et al.Ispitan je i upoređen uticaj geometrije AFM sonde na izmereni Youngov modul uzoraka mehanički homogenog hidrogela i heterogenih ćelija.Oni navode da vrijednosti modula u velikoj mjeri ovise o odabiru konzole i obliku vrha, s najvišom vrijednošću za sondu u obliku piramide i najnižom vrijednošću od 42 za sferičnu sondu.Slično, Selhuber-Unkel et al.Pokazano je kako brzina utiskivača, veličina i debljina indentora poliakrilamida (PAAM) uzoraka utječu na Youngov modul mjeren ACM43 nanoindentacijom.Još jedan komplicirajući faktor je nedostatak standardnih materijala za ispitivanje ekstremno niskog modula i besplatnih ispitnih procedura.Zbog toga je vrlo teško dobiti precizne rezultate s povjerenjem.Međutim, metoda je vrlo korisna za relativna mjerenja i komparativne procjene između sličnih tipova uzoraka, na primjer korištenjem AFM nanoindentacije za razlikovanje normalnih ćelija od ćelija raka 44, 45 .
Prilikom testiranja mekih materijala s AFM nanoindentacijom, opće pravilo je korištenje sonde s niskom konstantom opruge (k) koja blisko odgovara modulu uzorka i hemisferičnim/okruglim vrhom tako da prva sonda ne probije površine uzorka na prvi kontakt sa mekim materijalima.Takođe je važno da signal otklona koji generiše sonda bude dovoljno jak da ga detektor laserski sistem detektuje24,34,46,47.U slučaju ultra-mekih heterogenih ćelija, tkiva i gelova, drugi izazov je savladavanje sile lepljenja između sonde i površine uzorka kako bi se osigurala ponovljiva i pouzdana merenja48,49,50.Do nedavno, većina radova na AFM nanoindentaciji bila je fokusirana na proučavanje mehaničkog ponašanja bioloških ćelija, tkiva, gelova, hidrogelova i biomolekula koristeći relativno velike sferne sonde, koje se obično nazivaju koloidne sonde (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Ovi vrhovi imaju radijus od 1 do 50 µm i obično su napravljeni od borosilikatnog stakla, polimetil metakrilata (PMMA), polistirena (PS), silicijum dioksida (SiO2) i dijamanata. poput ugljenika (DLC).Iako je CP-AFM nanoindentacija često prvi izbor za karakterizaciju mekog uzorka, ona ima svoje probleme i ograničenja.Upotreba velikih sferičnih vrhova mikronske veličine povećava ukupnu površinu kontakta vrha sa uzorkom i rezultira značajnim gubitkom prostorne rezolucije.Za meke, nehomogene uzorke, gdje se mehanička svojstva lokalnih elemenata mogu značajno razlikovati od prosjeka na širem području, CP udubljenje može sakriti bilo kakvu nehomogenost svojstava na lokalnoj skali52.Koloidne sonde se obično prave pričvršćivanjem koloidnih sfera mikronske veličine na konzole bez vrha pomoću epoksidnih ljepila.Sam proces proizvodnje prepun je mnogih problema i može dovesti do nedosljednosti u procesu kalibracije sonde.Osim toga, veličina i masa koloidnih čestica direktno utiču na glavne kalibracione parametre konzole, kao što su rezonantna frekvencija, krutost opruge i osjetljivost na otklon56,57,58.Stoga, najčešće korištene metode za konvencionalne AFM sonde, kao što je kalibracija temperature, možda neće pružiti preciznu kalibraciju za CP, a druge metode mogu biti potrebne za izvođenje ovih korekcija57, 59, 60, 61. Tipični eksperimenti CP udubljenja koriste velika odstupanja konzole za proučavaju svojstva mekih uzoraka, što stvara još jedan problem pri kalibraciji nelinearnog ponašanja konzole pri relativno velikim devijacijama62,63,64.Moderne metode utiskivanja koloidne sonde obično uzimaju u obzir geometriju konzole koja se koristi za kalibraciju sonde, ali zanemaruju utjecaj koloidnih čestica, što stvara dodatnu nesigurnost u točnosti metode38,61.Slično tome, moduli elastičnosti izračunati uklapanjem kontaktnog modela direktno zavise od geometrije sonde za utiskivanje, a neusklađenost između karakteristika vrha i površine uzorka može dovesti do nepreciznosti27, 65, 66, 67, 68. Neki noviji radovi Spencera et al.Istaknuti su faktori koje treba uzeti u obzir pri karakterizaciji mekih polimernih četkica metodom CP-AFM nanoindentacije.Izvijestili su da zadržavanje viskoznog fluida u polimernim četkama kao funkcija brzine rezultira povećanjem opterećenja glave, a time i različitim mjerenjima svojstava ovisnih o brzini30,69,70,71.
U ovoj studiji smo okarakterisali površinski modul ultra mekog visoko elastičnog materijala lehfilcon A CL koristeći modifikovanu AFM metodu nanoindentacije.S obzirom na svojstva i novu strukturu ovog materijala, opseg osjetljivosti tradicionalne metode utiskivanja očito je nedovoljan za karakterizaciju modula ovog izuzetno mekog materijala, pa je potrebno koristiti AFM nanoindentacioni metod veće osjetljivosti i manje osjetljivosti.nivo.Nakon pregleda nedostataka i problema postojećih tehnika nanoindentacije koloidne AFM sonde, pokazujemo zašto smo odabrali manju, posebno dizajniranu AFM sondu da eliminišemo osjetljivost, pozadinsku buku, tačku kontakta, mjerimo modul brzine mekih heterogenih materijala kao što je zadržavanje tekućine zavisnost.i tačna kvantifikacija.Osim toga, uspjeli smo precizno izmjeriti oblik i dimenzije vrha udubljenja, što nam je omogućilo da koristimo model uklapanja konusne sfere za određivanje modula elastičnosti bez procjene površine kontakta vrha s materijalom.Dvije implicitne pretpostavke koje su kvantificirane u ovom radu su svojstva potpuno elastičnog materijala i modul neovisan o dubini udubljenja.Koristeći ovu metodu, prvo smo testirali ultra-meke standarde sa poznatim modulom da bismo kvantificirali metodu, a zatim smo koristili ovu metodu za karakterizaciju površina dva različita materijala kontaktnih sočiva.Očekuje se da će ova metoda karakterizacije AFM nanoindentiranih površina sa povećanom osjetljivošću biti primjenjiva na širok spektar biomimetičkih heterogenih ultramekih materijala s potencijalnom upotrebom u medicinskim uređajima i biomedicinskim aplikacijama.
Lehfilcon A kontaktna sočiva (Alcon, Fort Worth, Teksas, SAD) i njihovi silikon hidrogel supstrati odabrani su za eksperimente nanoindentacije.U eksperimentu je korišten posebno dizajniran nosač objektiva.Za postavljanje sočiva za testiranje, pažljivo je postavljeno na postolje u obliku kupole, pazeći da unutra ne uđu mjehurići zraka, a zatim fiksirano ivicama.Rupa u držaču na vrhu držača sočiva omogućava pristup optičkom centru sočiva za eksperimente nanoindentacije dok se tekućina drži na mjestu.Ovo održava sočiva potpuno hidratizirana.500 μl rastvora za pakovanje kontaktnih sočiva korišćeno je kao test rastvor.Da bi se potvrdili kvantitativni rezultati, komercijalno dostupni neaktivirani poliakrilamid (PAAM) hidrogelovi su pripremljeni od poliakrilamid-ko-metilen-bisakrilamidne kompozicije (100 mm Petrisoft Petrijeve zdjelice, Matrigen, Irvine, Kalifornija, SAD), poznatog modula elastičnosti od 1 kPa.Koristite 4-5 kapi (približno 125 µl) fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS iz Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, SAD) i 1 kap rastvora za kontaktna sočiva OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, SAD).) na interfejsu AFM hidrogel-sonda.
Uzorci Lehfilcon A CL i SiHy supstrata vizualizirani su pomoću FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM) sistema opremljenog detektorom skenirajućeg transmisionog elektronskog mikroskopa (STEM).Za pripremu uzoraka, sočiva su prvo oprana vodom i izrezana na klinove u obliku pite.Da bi se postigao diferencijalni kontrast između hidrofilne i hidrofobne komponente uzoraka, kao boja je korištena 0,10% stabilizirana otopina RuO4 u koju su uzorci uronjeni na 30 min.Bojenje lehfilcon A CL RuO4 važno je ne samo za postizanje poboljšanog diferencijalnog kontrasta, već i pomaže da se očuva struktura razgranatih polimernih četkica u njihovom originalnom obliku, koji su tada vidljivi na STEM slikama.Zatim su isprani i dehidrirani u nizu mješavina etanol/voda uz povećanje koncentracije etanola.Uzorci su zatim izliveni EMBed 812/Araldite epoksidom, koji je očvrsnuo preko noći na 70°C.Blokovi uzoraka dobiveni polimerizacijom smole izrezani su ultramikrotomom, a dobiveni tanki rezovi su vizualizirani STEM detektorom u režimu niskog vakuuma pri ubrzavajućem naponu od 30 kV.Isti SEM sistem je korišten za detaljnu karakterizaciju PFQNM-LC-A-CAL AFM sonde (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornija, SAD).SEM slike AFM sonde su dobijene u tipičnom režimu visokog vakuuma sa ubrzavajućim naponom od 30 kV.Nabavite slike pod različitim uglovima i uvećanjima kako biste snimili sve detalje o obliku i veličini vrha AFM sonde.Sve dimenzije vrha od interesa na slikama izmjerene su digitalno.
Mikroskop atomske sile Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornija, SAD) sa “PeakForce QNM in Fluid” modom je korišten za vizualizaciju i nanoindentiranje lehfilcon A CL, SiHy supstrata i PAAm hidrogela.Za slikovne eksperimente korišćena je PEAKFORCE-HIRS-FA sonda (Bruker) sa nominalnim radijusom vrha od 1 nm za snimanje slika visoke rezolucije uzorka pri brzini skeniranja od 0,50 Hz.Sve slike su snimljene u vodenom rastvoru.
Eksperimenti AFM nanoindentacije izvedeni su pomoću PFQNM-LC-A-CAL sonde (Bruker).AFM sonda ima silikonski vrh na nitridnoj konzoli debljine 345 nm, dužine 54 µm i širine 4,5 µm sa rezonantnom frekvencijom od 45 kHz.Posebno je dizajniran za karakterizaciju i izvođenje kvantitativnih nanomehaničkih mjerenja na mekim biološkim uzorcima.Senzori se individualno kalibriraju u tvornici s unaprijed kalibriranim postavkama opruge.Konstante opruge sondi korištenih u ovom istraživanju bile su u rasponu od 0,05–0,1 N/m.Da bi se precizno odredio oblik i veličina vrha, sonda je detaljno okarakterizirana pomoću SEM.Na sl.Slika 1a prikazuje skenirajuću elektronsku mikrografiju visoke rezolucije i malog povećanja PFQNM-LC-A-CAL sonde, pružajući holistički pogled na dizajn sonde.Na sl.1b prikazuje uvećani prikaz vrha sonde, pružajući informacije o obliku i veličini vrha.Na krajnjem kraju igla je hemisfera prečnika oko 140 nm (slika 1c).Ispod toga vrh se sužava u konusni oblik, dostižući izmjerenu dužinu od približno 500 nm.Izvan područja suženja, vrh je cilindričan i završava se u ukupnoj dužini vrha od 1,18 µm.Ovo je glavni funkcionalni dio vrha sonde.Osim toga, velika sferična polistirenska (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, SAD) s prečnikom vrha od 45 µm i konstantom opruge od 2 N/m također je korištena za testiranje kao koloidna sonda.sa PFQNM-LC-A-CAL sondom od 140 nm za poređenje.
Prijavljeno je da tečnost može biti zarobljena između AFM sonde i strukture polimerne četkice tokom nanoindentacije, što će vršiti silu prema gore na AFM sondu prije nego što ona stvarno dodirne površinu69.Ovaj efekat viskoznog istiskivanja zbog zadržavanja tečnosti može promeniti prividnu tačku kontakta, čime utiče na merenje površinskog modula.Da bi se proučavao uticaj geometrije sonde i brzine udubljenja na zadržavanje tečnosti, krive sile utiskivanja su nacrtane za lehfilcon A CL uzorke koristeći sondu prečnika 140 nm pri konstantnim brzinama pomaka od 1 µm/s i 2 µm/s.prečnik sonde 45 µm, fiksna postavka sile 6 nN postignuta pri 1 µm/s.Eksperimenti sa sondom prečnika 140 nm izvedeni su pri brzini uvlačenja od 1 µm/s i postavljenoj sili od 300 pN, odabranoj da stvori kontaktni pritisak unutar fiziološkog opsega (1-8 kPa) gornjeg kapka.pritisak 72. Meki gotovi uzorci PAA hidrogela sa pritiskom od 1 kPa ispitani su na silu utiskivanja od 50 pN pri brzini od 1 μm/s pomoću sonde prečnika 140 nm.
Budući da je dužina konusnog dijela vrha PFQNM-LC-A-CAL sonde približno 500 nm, za bilo koju dubinu udubljenja < 500 nm može se sa sigurnošću pretpostaviti da će geometrija sonde tokom udubljenja ostati ista konusni oblik.Osim toga, pretpostavlja se da će površina materijala koji se ispituje pokazati reverzibilni elastični odgovor, što će također biti potvrđeno u sljedećim odjeljcima.Stoga, ovisno o obliku i veličini vrha, za obradu naših eksperimenata s AFM nanoindentacijom (NanoScope) odabrali smo model uklapanja konusne kugle koji su razvili Briscoe, Sebastian i Adams, a koji je dostupan u softveru dobavljača.Softver za analizu podataka o razdvajanju, Bruker) 73. Model opisuje odnos sila-pomak F(δ) za konus sa sfernim defektom vrha.Na sl.Slika 2 prikazuje kontaktnu geometriju tokom interakcije krutog stošca sa sfernim vrhom, gdje je R polumjer sfernog vrha, a je kontaktni polumjer, b je kontaktni polumjer na kraju sfernog vrha, δ je kontaktni radijus.dubina udubljenja, θ je poluugao konusa.SEM slika ove sonde jasno pokazuje da se sferni vrh prečnika 140 nm tangencijalno spaja u konus, pa je ovde b definisan samo kroz R, tj. b = R cos θ.Softver koji je isporučio dobavljač pruža odnos konusne sfere za izračunavanje vrijednosti Youngovog modula (E) iz podataka o razdvajanju sila pod pretpostavkom a > b.Veza:
gdje je F sila utiskivanja, E je Youngov modul, ν je Poissonov omjer.Kontaktni radijus a može se procijeniti korištenjem:
Šema kontaktne geometrije krutog konusa sa sfernim vrhom utisnutim u materijal Lefilcon kontaktnog sočiva s površinskim slojem razgranatih polimernih četkica.
Ako je a ≤ b, relacija se svodi na jednadžbu za konvencionalni sferni indenter;
Vjerujemo da će interakcija sonde za utiskivanje s razgranatom strukturom PMPC polimerne četke uzrokovati da kontaktni radijus a bude veći od sfernog kontaktnog radijusa b.Stoga smo za sva kvantitativna mjerenja modula elastičnosti obavljena u ovoj studiji koristili ovisnost dobivenu za slučaj a > b.
Ultrameki biomimetički materijali proučavani u ovoj studiji su sveobuhvatno snimljeni pomoću skenirajuće transmisione elektronske mikroskopije (STEM) poprečnog presjeka uzorka i mikroskopije atomske sile (AFM) površine.Ova detaljna karakterizacija površine izvedena je kao proširenje našeg prethodno objavljenog rada, u kojem smo utvrdili da dinamički razgranana polimerna struktura četkice PMPC-modificirane lehfilcon A CL površine pokazuje slična mehanička svojstva kao nativno tkivo rožnjače 14 .Iz tog razloga površine kontaktnih sočiva nazivamo biomimetičkim materijalima14.Na sl.Na slikama 3a,b prikazani su poprečni presjeci razgranatih PMPC polimernih struktura četkica na površini lehfilcon A CL supstrata i neobrađenog SiHy supstrata, respektivno.Površine oba uzorka dodatno su analizirane pomoću AFM slika visoke rezolucije, što je dodatno potvrdilo rezultate STEM analize (sl. 3c, d).Uzeti zajedno, ove slike daju približnu dužinu strukture PMPC razgranate polimerne četkice na 300–400 nm, što je kritično za tumačenje AFM nanoindentacije mjerenja.Još jedno ključno zapažanje izvedeno iz slika je da je ukupna površinska struktura CL biomimetičkog materijala morfološki različita od one SiHy supstratnog materijala.Ova razlika u njihovoj površinskoj morfologiji može postati očigledna tokom njihove mehaničke interakcije sa indentiranom AFM sondom i nakon toga u izmjerenim vrijednostima modula.
STEM slike poprečnog presjeka (a) lehfilcon A CL i (b) SiHy supstrata.Skala bar, 500 nm.AFM slike površine lehfilcon A CL supstrata (c) i osnovnog SiHy supstrata (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirirani polimeri i strukture polimernih četki su inherentno mekane i naširoko su proučavane i korištene u različitim biomedicinskim primjenama74,75,76,77.Stoga je važno koristiti metodu AFM nanoindentacije, koja može precizno i ​​pouzdano izmjeriti njihova mehanička svojstva.Ali u isto vrijeme, jedinstvena svojstva ovih ultra-mekih materijala, kao što su izuzetno nizak modul elastičnosti, visok sadržaj tekućine i visoka elastičnost, često otežavaju odabir pravog materijala, oblika i oblika sonde za utiskivanje.veličina.Ovo je važno kako indenter ne bi probušio mekanu površinu uzorka, što bi dovelo do grešaka u određivanju tačke kontakta sa površinom i površine kontakta.
Za ovo je neophodno sveobuhvatno razumijevanje morfologije ultra-mekih biomimetičkih materijala (lehfilcon A CL).Podaci o veličini i strukturi razgranatih polimernih četkica dobiveni metodom snimanja predstavljaju osnovu za mehaničku karakterizaciju površine korištenjem AFM tehnika nanoindentacije.Umjesto sferičnih koloidnih sondi mikronske veličine, odabrali smo sondu sa silicijum nitridom PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) sa prečnikom vrha od 140 nm, posebno dizajniranu za kvantitativno mapiranje mehaničkih svojstava bioloških uzoraka 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Razlog za upotrebu relativno oštrih sondi u poređenju sa konvencionalnim koloidnim sondama može se objasniti strukturnim karakteristikama materijala.Upoređujući veličinu vrha sonde (~140 nm) sa razgranatim polimernim četkicama na površini CL lehfilcon A, prikazanom na slici 3a, može se zaključiti da je vrh dovoljno velik da dođe u direktan kontakt sa ovim strukturama četkice, koje smanjuje mogućnost da vrh probije kroz njih.Da bismo ilustrovali ovu tačku, na slici 4 je STEM slika lehfilcon A CL i uvučeni vrh AFM sonde (nacrtan u mjerilu).
Šematski prikaz STEM slike lehfilcon A CL i ACM indentacione sonde (nacrtana u mjerilu).
Osim toga, veličina vrha od 140 nm je dovoljno mala da izbjegne rizik od bilo kojeg od ljepljivih efekata ekstruzije koji su ranije prijavljeni za polimerne četke proizvedene CP-AFM metodom nanoindentacije69,71.Pretpostavljamo da zbog specijalnog konusno-sfernog oblika i relativno male veličine ovog AFM vrha (slika 1), priroda krivulje sile koju generiše lehfilcon A CL nanoindentacija neće zavisiti od brzine utiskivanja ili brzine utovara/istovara. .Stoga na njega ne utiču poroelastični efekti.Da bi se testirala ova hipoteza, lehfilcon A CL uzorci su uvučeni pri fiksnoj maksimalnoj sili pomoću sonde PFQNM-LC-A-CAL, ali pri dvije različite brzine, a rezultirajuće krivulje vlačne i povlačenja korištene su za crtanje sile (nN) u razdvajanju (µm) prikazano je na slici 5a.Jasno je da se krivulje sile tijekom utovara i istovara u potpunosti preklapaju, a nema jasnih dokaza da se smicanje sile pri nultoj dubini udubljenja povećava sa brzinom utiskivanja na slici, što sugerira da su pojedinačni elementi četke karakterizirani bez poroelastičnog efekta.Nasuprot tome, efekti zadržavanja tekućine (efekti viskozne ekstruzije i poroelastičnosti) su evidentni za AFM sondu prečnika 45 µm pri istoj brzini utiskivanja i naglašeni su histerezom između krivulja rastezanja i uvlačenja, kao što je prikazano na slici 5b.Ovi rezultati podržavaju hipotezu i sugeriraju da su sonde prečnika 140 nm dobar izbor za karakterizaciju takvih mekih površina.
lehfilcon A CL krivulje sile udubljenja koristeći ACM;(a) korišćenje sonde prečnika 140 nm pri dve brzine opterećenja, što pokazuje odsustvo poroelastičnog efekta tokom površinskog utiskivanja;(b) korišćenjem sondi prečnika 45 µm i 140 nm.s pokazuju efekte viskozne ekstruzije i poroelastičnosti za velike sonde u poređenju sa manjim sondama.
Za karakterizaciju ultramekih površina, metode AFM nanoindentacije moraju imati najbolju sondu za proučavanje svojstava materijala koji se proučava.Osim oblika i veličine vrha, osjetljivost AFM detektorskog sistema, osjetljivost na otklon vrha u okruženju za testiranje i krutost konzole igraju važnu ulogu u određivanju tačnosti i pouzdanosti nanoindentiranja.mjerenja.Za naš AFM sistem, granica detekcije osetljivog na položaj (PSD) je približno 0,5 mV i zasniva se na unapred kalibriranoj brzini opruge i izračunatoj osetljivosti na otklon tečnosti PFQNM-LC-A-CAL sonde, koja odgovara teorijska osjetljivost na opterećenje.je manji od 0,1 pN.Stoga ova metoda omogućava mjerenje minimalne sile utiskivanja ≤ 0,1 pN bez ikakve periferne komponente buke.Međutim, gotovo je nemoguće da AFM sistem smanji perifernu buku na ovaj nivo zbog faktora kao što su mehaničke vibracije i dinamika fluida.Ovi faktori ograničavaju ukupnu osjetljivost AFM metode nanoindentacije i također rezultiraju signalom pozadinske buke od približno ≤ 10 pN.Za površinsku karakterizaciju, lehfilcon A CL i SiHy uzorci supstrata su uvučeni u potpuno hidratiziranim uvjetima korištenjem 140 nm sonde za SEM karakterizaciju, a rezultirajuće krive sile su superponirane između sile (pN) i pritiska.Grafikon razdvajanja (µm) prikazan je na slici 6a.U poređenju sa SiHy baznom podlogom, kriva lehfilcon A CL sile jasno pokazuje prelaznu fazu koja počinje u tački kontakta sa račvastom polimernom četkom i završava se oštrom promenom u kontaktu vrha sa osnovnim materijalom koji označava nagib.Ovaj prijelazni dio krivulje sile naglašava istinski elastično ponašanje razgranate polimerne četke na površini, o čemu svjedoči krivulja kompresije koja blisko prati krivulju napetosti i kontrast u mehaničkim svojstvima između strukture četke i glomaznog SiHy materijala.Kada se poredi lefilcon.Razdvajanje srednje dužine razgranate polimerne četke na STEM snimku PCS-a (slika 3a) i njegove krive sile duž apscise na slici 3a.Slika 6a pokazuje da je metoda u stanju otkriti vrh i razgranati polimer koji dosežu do samog vrha površine.Kontakt između struktura četkica.Osim toga, blisko preklapanje krivulja sile ukazuje na to da nema efekta zadržavanja tekućine.U ovom slučaju ne postoji apsolutno nikakvo prianjanje između igle i površine uzorka.Najgornji dijelovi krivulje sile za dva uzorka se preklapaju, što odražava sličnost mehaničkih svojstava materijala podloge.
(a) krive sile AFM nanoindentacije za lehfilcon A CL supstrate i SiHy supstrate, (b) krive sile koje pokazuju procjenu kontaktne točke korištenjem metode praga pozadinske buke.
U cilju proučavanja finijih detalja krivulje sile, krivulja napetosti uzorka lehfilcon A CL ponovo je nacrtana na slici 6b sa maksimalnom silom od 50 pN duž y-ose.Ovaj grafikon pruža važne informacije o izvornoj pozadinskoj buci.Šum je u rasponu od ±10 pN, koji se koristi za precizno određivanje kontaktne točke i izračunavanje dubine udubljenja.Kao što je objavljeno u literaturi, identifikacija kontaktnih tačaka je kritična za tačnu procjenu svojstava materijala kao što je modul85.Pristup koji uključuje automatsku obradu podataka krivulje sile pokazao je poboljšanu usklađenost između uklapanja podataka i kvantitativnih mjerenja za mekane materijale86.U ovom radu naš izbor dodirnih tačaka je relativno jednostavan i objektivan, ali ima svoja ograničenja.Naš konzervativni pristup određivanju tačke kontakta može rezultirati neznatno precijenjenim vrijednostima modula za manje dubine udubljenja (< 100 nm).Upotreba detekcije dodirnih tačaka zasnovanih na algoritmu i automatizovane obrade podataka mogla bi biti nastavak ovog rada u budućnosti na daljem poboljšanju naše metode.Stoga, za intrinzičnu pozadinsku buku reda ±10 pN, definišemo kontaktnu tačku kao prvu tačku podataka na x-osi na slici 6b sa vrijednošću od ≥10 pN.Zatim, u skladu sa pragom buke od 10 pN, vertikalna linija na nivou od ~0,27 µm označava tačku kontakta sa površinom, nakon čega se kriva rastezanja nastavlja sve dok podloga ne dostigne dubinu udubljenja od ~270 nm.Zanimljivo je da na osnovu veličine razgranatog polimernog kista (300–400 nm) izmjerene metodom snimanja, dubina udubljenja CL lehfilcon A uzorka posmatranog metodom praga pozadinske buke iznosi oko 270 nm, što je vrlo blizu veličina mjerenja sa STEM.Ovi rezultati dodatno potvrđuju kompatibilnost i primjenjivost oblika i veličine vrha AFM sonde za utiskivanje ove vrlo meke i visoko elastične razgranate polimerne strukture četkice.Ovi podaci također pružaju snažne dokaze koji podržavaju našu metodu korištenja pozadinske buke kao praga za precizno određivanje kontaktnih tačaka.Stoga bi svi kvantitativni rezultati dobiveni matematičkim modeliranjem i prilagođavanjem krivulje sile trebali biti relativno točni.
Kvantitativna mjerenja AFM metodama nanoindentacije u potpunosti zavise od matematičkih modela koji se koriste za odabir podataka i naknadnu analizu.Stoga je važno uzeti u obzir sve faktore koji se odnose na izbor utiskivača, svojstva materijala i mehaniku njihove interakcije prije odabira određenog modela.U ovom slučaju, geometrija vrha je pažljivo okarakterisana pomoću SEM mikrografa (slika 1), a na osnovu rezultata, AFM nanoindentirajuća sonda prečnika 140 nm sa tvrdim konusom i sferičnom geometrijom vrha je dobar izbor za karakterizaciju lehfilcon A CL79 uzoraka. .Još jedan važan faktor koji treba pažljivo procijeniti je elastičnost polimernog materijala koji se testira.Iako početni podaci nanoindentacije (slike 5a i 6a) jasno ocrtavaju karakteristike preklapanja krivulja zatezanja i kompresije, odnosno potpunog elastičnog oporavka materijala, izuzetno je važno potvrditi čisto elastičnu prirodu kontakata. .U tu svrhu izvršena su dva uzastopna udubljenja na istoj lokaciji na površini uzorka lehfilcon A CL pri brzini udubljenja od 1 µm/s pod uvjetima pune hidratacije.Rezultirajući podaci krive sile prikazani su na sl.7 i, kao što se očekivalo, krivulje ekspanzije i kompresije dva otiska su gotovo identične, naglašavajući visoku elastičnost strukture razgranate polimerne četke.
Dvije krivulje sile udubljenja na istoj lokaciji na površini lehfilcon A CL ukazuju na idealnu elastičnost površine sočiva.
Na osnovu informacija dobijenih iz SEM i STEM slika vrha sonde i lehfilcon A CL površine, respektivno, model konusne sfere je razuman matematički prikaz interakcije između vrha AFM sonde i mekog polimernog materijala koji se testira.Osim toga, za ovaj model konusne sfere, osnovne pretpostavke o elastičnim svojstvima utisnutog materijala vrijede za ovaj novi biomimetički materijal i koriste se za kvantifikaciju modula elastičnosti.
Nakon sveobuhvatne procene AFM metode nanoindentacije i njenih komponenti, uključujući svojstva indentacione sonde (oblik, veličina i krutost opruge), osetljivost (pozadinska buka i procena kontaktnih tačaka) i modele uklapanja podataka (kvantitativna merenja modula), metoda je korišteno.karakteriziraju komercijalno dostupne ultra-meke uzorke kako bi se potvrdili kvantitativni rezultati.Komercijalni poliakrilamid (PAAM) hidrogel sa modulom elastičnosti od 1 kPa testiran je u hidratizovanim uslovima pomoću sonde od 140 nm.Detalji testiranja i proračuna modula dati su u Dodatnim informacijama.Rezultati su pokazali da je prosječni izmjereni modul bio 0,92 kPa, a %RSD i postotak (%) odstupanja od poznatog modula manji od 10%.Ovi rezultati potvrđuju tačnost i reproduktivnost metode AFM nanoindentacije koja se koristi u ovom radu za mjerenje modula ultramekih materijala.Površine lehfilcon A CL uzoraka i SiHy baznog supstrata su dalje karakterizirane korištenjem iste AFM metode nanoindentacije za proučavanje prividnog kontaktnog modula ultrameke površine kao funkcije dubine udubljenja.Krivulje razdvajanja sile udubljenja generirane su za tri uzorka svakog tipa (n = 3; jedno udubljenje po uzorku) pri sili od 300 pN, brzini od 1 µm/s i punoj hidrataciji.Krivulja podjele sile udubljenja aproksimirana je korištenjem modela konusne sfere.Da bi se dobio modul koji ovisi o dubini udubljenja, 40 nm širok dio krivulje sile je postavljen na svakom koraku od 20 nm počevši od točke kontakta i mjerene vrijednosti modula na svakom koraku krivulje sile.Spin Cy et al.Sličan pristup korišten je za karakterizaciju gradijenta modula poli(lauril metakrilata) (P12MA) polimernih četkica korištenjem koloidne AFM nanoindentacije sonde, a oni su u skladu s podacima korištenjem Hertz kontaktnog modela.Ovaj pristup daje dijagram prividnog kontaktnog modula (kPa) u odnosu na dubinu udubljenja (nm), kao što je prikazano na slici 8, koja ilustruje gradijent prividnog kontaktnog modula/dubine.Izračunati modul elastičnosti uzorka CL lehfilcon A je u rasponu od 2-3 kPa unutar gornjih 100 nm uzorka, nakon čega počinje rasti s dubinom.S druge strane, pri testiranju SiHy bazne podloge bez filma poput četkice na površini, maksimalna dubina udubljenja postignuta pri sili od 300 pN je manja od 50 nm, a vrijednost modula dobivena iz podataka je oko 400 kPa. , što je uporedivo sa vrijednostima Youngovog modula za rasute materijale.
Prividni kontaktni modul (kPa) naspram dubine udubljenja (nm) za lehfilcon A CL i SiHy supstrate koristeći AFM metodu nanoindentacije sa geometrijom konusne sfere za mjerenje modula.
Najgornja površina nove biomimetičke razgranate polimerne strukture četkice pokazuje izuzetno nizak modul elastičnosti (2-3 kPa).Ovo će odgovarati slobodnom visećem kraju račvaste polimerne četke kao što je prikazano na STEM slici.Iako postoje neki dokazi o gradijentu modula na vanjskoj ivici CL, glavni supstrat visokog modula je utjecajniji.Međutim, gornjih 100 nm površine je unutar 20% ukupne dužine razgranate polimerne četke, tako da je razumno pretpostaviti da su izmjerene vrijednosti modula u ovom rasponu dubine udubljenja relativno točne i da nisu jako zavisi od efekta donjeg objekta.
Zbog jedinstvenog biomimetičkog dizajna lehfilcon A kontaktnih sočiva, koje se sastoje od razgranatih PMPC polimernih struktura četkica cijepljenih na površinu SiHy supstrata, vrlo je teško pouzdano okarakterizirati mehanička svojstva njihovih površinskih struktura koristeći tradicionalne metode mjerenja.Ovdje predstavljamo naprednu AFM metodu nanoindentacije za preciznu karakterizaciju ultra-mekih materijala kao što je lefilkon A sa visokim sadržajem vode i izuzetno visokom elastičnošću.Ova metoda se zasniva na upotrebi AFM sonde čija su veličina i geometrija vrha pažljivo odabrani kako bi odgovarali strukturnim dimenzijama ultra mekih površinskih karakteristika koje se utiskuju.Ova kombinacija dimenzija između sonde i strukture pruža povećanu osjetljivost, omogućavajući nam mjerenje niskog modula i inherentnih elastičnih svojstava razgranatih polimernih elemenata četkice, bez obzira na poroelastične efekte.Rezultati su pokazali da jedinstvene razgranate PMPC polimerne četkice karakteristične za površinu sočiva imaju ekstremno nizak modul elastičnosti (do 2 kPa) i vrlo visoku elastičnost (skoro 100%) kada su testirani u vodenom okruženju.Rezultati AFM nanoindentacije takođe su nam omogućili da karakterišemo prividni kontaktni modul/gradijent dubine (30 kPa/200 nm) površine biomimetičkog sočiva.Ovaj gradijent može biti posljedica razlike modula između razgranatih polimernih četkica i SiHy supstrata, ili razgranate strukture/gustine polimernih četkica, ili njihove kombinacije.Međutim, potrebne su daljnje dubinske studije kako bi se u potpunosti razumjela veza između strukture i svojstava, posebno utjecaja grananja četke na mehanička svojstva.Slična mjerenja mogu pomoći u karakterizaciji mehaničkih svojstava površine drugih ultra-mekih materijala i medicinskih uređaja.
Skupovi podataka generisani i/ili analizirani tokom tekuće studije dostupni su od odgovarajućih autora na razuman zahtjev.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Biološke reakcije na fizička i hemijska svojstva površina biomaterijala.Hemijski.društvo.Ed.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Poboljšanje biomaterijala dobijenih od ljudi za inženjerstvo tkiva.programiranje.polimer.nauku.53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al.Dizajn, klinička implementacija i imuni odgovor biomaterijala u regenerativnoj medicini.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Poboljšana metoda za određivanje tvrdoće i modula elastičnosti korištenjem eksperimenata udubljenja s mjerenjem opterećenja i pomaka.J. Alma mater.rezervoar za skladištenje.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Povijesno porijeklo ispitivanja tvrdoće udubljenja.alma mater.nauku.tehnologije.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Mjerenja tvrdoće udubljenja na makro, mikro i nanoskali: Kritički pregled.pleme.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Greške u detekciji površine dovode do precjenjivanja modula u nanoindentiranju mekih materijala.J. Mecha.Ponašanje.Biomedical Science.alma mater.2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu.Evaluacija metode nanoindentiranja za određivanje mehaničkih karakteristika heterogenih nanokompozita eksperimentalnim i računskim metodama.nauku.Kuća 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, i Owart, TS Mehanička karakterizacija mekih viskoelastičnih gelova indentacijom i inverznom analizom konačnih elemenata zasnovanom na optimizaciji.J. Mecha.Ponašanje.Biomedical Science.alma mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optimizacija određivanja viskoelastičnosti korištenjem kompatibilnih mjernih sistema.Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentacija polimernih površina.J. Physics.D. Prijavite se za fiziku.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Karakterizacija viskoelastičnih mehaničkih svojstava visoko elastičnih polimera i bioloških tkiva korištenjem udarnog utiskivanja.Journal of Biomaterials.71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Procjena modula elastičnosti i rada prianjanja mekih materijala primjenom proširene metode Borodich-Galanov (BG) i dubokog utiskivanja.krzno.alma mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al.Morfologija nanorazmjera i mehanička svojstva biomimetičkih polimernih površina silikon hidrogel kontaktnih sočiva.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).