Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora.Utilitzeu els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora, o utilitzeu els botons lliscants al final per moure's per tres diapositives alhora.
Amb el desenvolupament de nous materials ultratous per a dispositius mèdics i aplicacions biomèdiques, la caracterització integral de les seves propietats físiques i mecàniques és important i desafiant.Es va aplicar una tècnica de nanoindentació de microscòpia de força atòmica modificada (AFM) per caracteritzar el mòdul superficial extremadament baix de la nova lent de contacte d'hidrogel de silicona biomimètica lehfilcon recoberta amb una capa d'estructures de raspall de polímer ramificat.Aquest mètode permet la determinació precisa dels punts de contacte sense els efectes de l'extrusió viscosa quan s'apropa a polímers ramificats.A més, permet determinar les característiques mecàniques dels elements individuals del raspall sense l'efecte de la poroelasticitat.Això s'aconsegueix seleccionant una sonda AFM amb un disseny (mida de punta, geometria i velocitat de molla) que és especialment adequat per mesurar les propietats de materials tous i mostres biològiques.Aquest mètode millora la sensibilitat i la precisió per a la mesura precisa del material molt tou lehfilcon A, que té un mòdul d'elasticitat extremadament baix a la superfície (fins a 2 kPa) i una elasticitat extremadament alta en l'entorn aquós intern (gairebé el 100%). .Els resultats de l'estudi de la superfície no només van revelar les propietats de la superfície ultra suau de la lent lehfilcon A, sinó que també van demostrar que el mòdul dels raspalls de polímer ramificat era comparable al del substrat de silici-hidrogen.Aquesta tècnica de caracterització de superfícies es pot aplicar a altres materials ultratous i dispositius mèdics.
Les propietats mecàniques dels materials dissenyats per al contacte directe amb teixits vius sovint estan determinades pel medi biològic.La combinació perfecta d'aquestes propietats del material ajuda a aconseguir les característiques clíniques desitjades del material sense provocar respostes cel·lulars adverses1,2,3.Per a materials homogenis a granel, la caracterització de les propietats mecàniques és relativament fàcil a causa de la disponibilitat de procediments estàndard i mètodes de prova (per exemple, microindentació4,5,6).Tanmateix, per a materials ultratous com ara gels, hidrogels, biopolímers, cèl·lules vives, etc., aquests mètodes de prova generalment no són aplicables a causa de les limitacions de resolució de mesura i la falta d'homogeneïtat d'alguns materials7.Al llarg dels anys, els mètodes tradicionals de sagnat s'han anat modificant i adaptant per caracteritzar una àmplia gamma de materials tous, però molts mètodes encara pateixen greus mancances que limiten el seu ús8,9,10,11,12,13.La manca de mètodes de prova especialitzats que puguin caracteritzar de manera precisa i fiable les propietats mecàniques dels materials supertous i les capes superficials limita severament el seu ús en diverses aplicacions.
En el nostre treball anterior, vam introduir la lent de contacte lehfilcon A (CL), un material heterogeni suau amb totes les propietats superficials ultratoues derivades de dissenys potencialment biomimètics inspirats en la superfície de la còrnia de l'ull.Aquest biomaterial es va desenvolupar empeltant una capa de polímer ramificat i reticulat de poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) sobre un hidrogel de silicona (SiHy) 15 dissenyat per a dispositius mèdics basats en.Aquest procés d'empelt crea una capa a la superfície formada per una estructura de raspall polimèric ramificat molt suau i molt elàstic.El nostre treball anterior ha confirmat que l'estructura biomimètica de lehfilcon A CL proporciona propietats superficials superiors, com ara una millora de la prevenció de la humectació i l'encrassement, l'augment de la lubricitat i la reducció de l'adhesió cel·lular i bacteriana15,16.A més, l'ús i el desenvolupament d'aquest material biomimètic també suggereix una major expansió a altres dispositius biomèdics.Per tant, és fonamental caracteritzar les propietats superficials d'aquest material ultra suau i comprendre la seva interacció mecànica amb l'ull per tal de crear una base de coneixement integral per donar suport a desenvolupaments i aplicacions futurs.La majoria de les lents de contacte de SiHy disponibles comercialment estan compostes per una barreja homogènia de polímers hidròfils i hidrofòbics que formen una estructura de material uniforme17.S'han realitzat diversos estudis per investigar les seves propietats mecàniques mitjançant mètodes tradicionals de prova de compressió, tracció i microindentació18,19,20,21.Tanmateix, el nou disseny biomimètic de lehfilcon A CL el converteix en un material heterogeni únic en el qual les propietats mecàniques de les estructures de raspall de polímer ramificat difereixen significativament de les del substrat base SiHy.Per tant, és molt difícil quantificar amb precisió aquestes propietats mitjançant mètodes convencionals i de sagnat.Un mètode prometedor utilitza el mètode de prova de nanoindentació implementat en la microscòpia de força atòmica (AFM), un mètode que s'ha utilitzat per determinar les propietats mecàniques de materials viscoelàstics tous com ara cèl·lules i teixits biològics, així com polímers tous22,23,24,25. .,26,27,28,29,30.A la nanoindentació AFM, els fonaments de les proves de nanoindentació es combinen amb els darrers avenços en la tecnologia AFM per proporcionar una major sensibilitat de mesura i proves d'una àmplia gamma de materials inherentment supersuaus31,32,33,34,35,36.A més, la tecnologia ofereix altres avantatges importants mitjançant l'ús de diferents geometries.sagnador i sonda i la possibilitat de provar en diversos medis líquids.
La nanoindentació AFM es pot dividir condicionalment en tres components principals: (1) equips (sensors, detectors, sondes, etc.);(2) paràmetres de mesura (com la força, el desplaçament, la velocitat, la mida de la rampa, etc.);(3) Tractament de dades (correcció de la línia de base, estimació del punt de contacte, ajust de dades, modelització, etc.).Un problema important d'aquest mètode és que diversos estudis de la literatura que utilitzen nanoindentació AFM informen de resultats quantitatius molt diferents per a la mateixa mostra/cèl·lula/tipus de material37,38,39,40,41.Per exemple, Lekka et al.Es va estudiar i comparar la influència de la geometria de la sonda AFM en el mòdul de Young mesurat de mostres d'hidrogel mecànicament homogeni i cèl·lules heterogènies.Informen que els valors del mòdul depenen molt de la selecció del voladís i de la forma de la punta, amb el valor més alt per a una sonda en forma de piràmide i el valor més baix de 42 per a una sonda esfèrica.De la mateixa manera, Selhuber-Unkel et al.S'ha demostrat com la velocitat del penetrador, la mida del penetrador i el gruix de les mostres de poliacrilamida (PAAM) afecten el mòdul de Young mesurat per nanoindentació ACM43.Un altre factor que complica és la manca de materials de prova de mòdul extremadament baix estàndard i procediments de prova gratuïts.Això fa que sigui molt difícil obtenir resultats precisos amb confiança.Tanmateix, el mètode és molt útil per a mesures relatives i avaluacions comparatives entre tipus de mostres similars, per exemple, utilitzant la nanoindentació AFM per distingir les cèl·lules normals de les cèl·lules canceroses 44, 45 .
Quan es proveu materials tous amb nanoindentació AFM, una regla general és utilitzar una sonda amb una constant de molla baixa (k) que coincideixi molt amb el mòdul de la mostra i una punta hemisfèrica/rodona perquè la primera sonda no perfori les superfícies de la mostra. primer contacte amb materials tous.També és important que el senyal de desviació generat per la sonda sigui prou fort per ser detectat pel sistema de detector làser24,34,46,47.En el cas de cèl·lules, teixits i gels heterogenis ultratous, un altre repte és superar la força adhesiva entre la sonda i la superfície de la mostra per garantir mesures reproduïbles i fiables48,49,50.Fins fa poc, la majoria dels treballs sobre nanoindentació AFM s'han centrat en l'estudi del comportament mecànic de cèl·lules biològiques, teixits, gels, hidrogels i biomolècules mitjançant sondes esfèriques relativament grans, comunament conegudes com a sondes col·loïdals (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Aquestes puntes tenen un radi d'1 a 50 µm i estan fetes habitualment de vidre de borosilicat, polimetilmetacrilat (PMMA), poliestirè (PS), diòxid de silici (SiO2) i diamant. com el carboni (DLC).Tot i que la nanoindentació CP-AFM és sovint la primera opció per a la caracterització de mostres suaus, té els seus propis problemes i limitacions.L'ús de puntes esfèriques grans i de mida micres augmenta l'àrea de contacte total de la punta amb la mostra i provoca una pèrdua important de resolució espacial.Per a exemplars tous i no homogenis, on les propietats mecàniques dels elements locals poden diferir significativament de la mitjana en una àrea més àmplia, la sagnia CP pot ocultar qualsevol inhomogeneïtat en les propietats a escala local52.Les sondes col·loïdals normalment es fan connectant esferes col·loïdals de mida micres a voladís sense puntes mitjançant adhesius epoxi.El procés de fabricació en si està ple de problemes i pot provocar inconsistències en el procés de calibratge de la sonda.A més, la mida i la massa de les partícules col·loïdals afecten directament els principals paràmetres de calibratge del voladís, com ara la freqüència de ressonància, la rigidesa de la molla i la sensibilitat a la deflexió56,57,58.Així, els mètodes utilitzats habitualment per a sondes AFM convencionals, com ara el calibratge de temperatura, poden no proporcionar un calibratge precís per a CP, i es poden requerir altres mètodes per realitzar aquestes correccions57, 59, 60, 61. Els experiments típics de sagnat de CP utilitzen grans desviacions en voladís per estudiar les propietats de les mostres toves, la qual cosa crea un altre problema en calibrar el comportament no lineal del voladís a desviacions relativament grans62,63,64.Els mètodes moderns de sagnat de la sonda col·loïdal solen tenir en compte la geometria del voladís utilitzat per calibrar la sonda, però ignoren la influència de les partícules col·loïdals, la qual cosa crea una incertesa addicional en la precisió del mètode38,61.De la mateixa manera, els mòduls elàstics calculats mitjançant l'ajust del model de contacte depenen directament de la geometria de la sonda de sagnat, i el desajust entre les característiques de la superfície de la punta i la mostra pot provocar inexactituds27, 65, 66, 67, 68. Alguns treballs recents de Spencer et al.Es destaquen els factors que s'han de tenir en compte a l'hora de caracteritzar els raspalls de polímer suau mitjançant el mètode de nanoindentació CP-AFM.Van informar que la retenció d'un fluid viscós als raspalls de polímer en funció de la velocitat provoca un augment de la càrrega del cap i, per tant, diferents mesures de propietats dependents de la velocitat30,69,70,71.
En aquest estudi, hem caracteritzat el mòdul superficial del material ultra suau molt elàstic lehfilcon A CL mitjançant un mètode de nanoindentació AFM modificat.Donades les propietats i la nova estructura d'aquest material, el rang de sensibilitat del mètode de sagnat tradicional és clarament insuficient per caracteritzar el mòdul d'aquest material extremadament suau, per la qual cosa és necessari utilitzar un mètode de nanoindentació AFM amb una sensibilitat més alta i una sensibilitat menor.nivell.Després de revisar les deficiències i els problemes de les tècniques de nanoindentació de la sonda AFM col·loïdal existents, mostrem per què hem escollit una sonda AFM més petita i dissenyada a mida per eliminar la sensibilitat, el soroll de fons, el punt de contacte puntual, mesurar el mòdul de velocitat de materials heterogenis tous com la retenció de líquids. dependència.i quantificació precisa.A més, vam poder mesurar amb precisió la forma i les dimensions de la punta de sagnat, cosa que ens va permetre utilitzar el model d'ajust de con-esfera per determinar el mòdul d'elasticitat sense avaluar l'àrea de contacte de la punta amb el material.Les dues hipòtesis implícites que es quantifiquen en aquest treball són les propietats del material totalment elàstic i el mòdul independent de la profunditat de sagnat.Mitjançant aquest mètode, primer vam provar estàndards ultra suaus amb un mòdul conegut per quantificar el mètode, i després vam utilitzar aquest mètode per caracteritzar les superfícies de dos materials de lents de contacte diferents.S'espera que aquest mètode de caracterització de superfícies de nanoindentació AFM amb una sensibilitat augmentada sigui aplicable a una àmplia gamma de materials ultratous heterogenis biomimètics amb un ús potencial en dispositius mèdics i aplicacions biomèdiques.
Les lents de contacte Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EUA) i els seus substrats d'hidrogel de silicona es van triar per a experiments de nanoindentació.En l'experiment es va utilitzar una montura de lent dissenyada especialment.Per instal·lar la lent per a la prova, es va col·locar amb cura al suport en forma de cúpula, assegurant-se que no hi entrés bombolles d'aire, i després es va fixar amb les vores.Un forat a la fixació a la part superior del suport de la lent proporciona accés al centre òptic de la lent per a experiments de nanoindentació mentre manté el líquid al seu lloc.Això manté les lents completament hidratades.Es van utilitzar 500 μl de solució d'envasament de lents de contacte com a solució de prova.Per verificar els resultats quantitatius, es van preparar hidrogels de poliacrilamida no activada (PAAM) disponibles comercialment a partir d'una composició de poliacrilamida-co-metilen-bisacrilamida (plaques Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EUA), un mòdul elàstic conegut d'1. kPa.Utilitzeu 4-5 gotes (aproximadament 125 µl) de solució salina tamponada amb fosfat (PBS de Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EUA) i 1 gota de solució de lents de contacte OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EUA).) a la interfície hidrogel-sonda AFM.
Es van visualitzar mostres de substrats de Lehfilcon A CL i SiHy mitjançant un sistema de microscopi electrònic d'escaneig d'emissió de camp FEI Quanta 250 (FEG SEM) equipat amb un detector de microscopi electrònic de transmissió d'escaneig (STEM).Per preparar les mostres, primer es rentaven les lents amb aigua i es tallaven en falques en forma de pastís.Per aconseguir un contrast diferencial entre els components hidròfils i hidròfobs de les mostres, es va utilitzar com a colorant una solució estabilitzada al 0,10% de RuO4, en la qual es van submergir les mostres durant 30 min.La tinció de lehfilcon A CL RuO4 és important no només per aconseguir un contrast diferencial millorat, sinó que també ajuda a preservar l'estructura dels pinzells de polímer ramificat en la seva forma original, que després són visibles a les imatges STEM.Després es van rentar i deshidratar en una sèrie de mescles d'etanol/aigua amb una concentració creixent d'etanol.A continuació, les mostres es van colar amb epoxi EMBed 812/Araldite, que es va curar durant la nit a 70 °C.Els blocs de mostra obtinguts per polimerització de resina es van tallar amb un ultramicròtom i les seccions primes resultants es van visualitzar amb un detector STEM en mode de baix buit a una tensió acceleradora de 30 kV.Es va utilitzar el mateix sistema SEM per a la caracterització detallada de la sonda PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA).Les imatges SEM de la sonda AFM es van obtenir en un mode d'alt buit típic amb una tensió acceleradora de 30 kV.Adquirir imatges amb diferents angles i augments per registrar tots els detalls de la forma i la mida de la punta de la sonda AFM.Totes les dimensions de punta d'interès de les imatges es van mesurar digitalment.
Es va utilitzar un microscopi de força atòmica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA) amb el mode "PeakForce QNM in Fluid" per visualitzar i nanoindentar mostres d'hidrogel de lehfilcon A CL, SiHy i PAAm.Per a experiments d'imatge, es va utilitzar una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) amb un radi de punta nominal d'1 nm per capturar imatges d'alta resolució de la mostra a una velocitat d'exploració de 0,50 Hz.Totes les imatges es van prendre en solució aquosa.
Els experiments de nanoindentació AFM es van dur a terme mitjançant una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).La sonda AFM té una punta de silici en un voladís de nitrur de 345 nm de gruix, 54 µm de llarg i 4,5 µm d'amplada amb una freqüència de ressonància de 45 kHz.Està dissenyat específicament per caracteritzar i realitzar mesures nanomecàniques quantitatives en mostres biològiques toves.Els sensors es calibran individualment a la fàbrica amb paràmetres de molla precalibrats.Les constants de molla de les sondes utilitzades en aquest estudi estaven en el rang de 0,05-0,1 N/m.Per determinar amb precisió la forma i la mida de la punta, la sonda es va caracteritzar amb detall mitjançant SEM.A la fig.La figura 1a mostra una micrografia electrònica d'escaneig d'alta resolució i baixa ampliació de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que proporciona una visió holística del disseny de la sonda.A la fig.La figura 1b mostra una vista ampliada de la part superior de la punta de la sonda, proporcionant informació sobre la forma i la mida de la punta.A l'extrem extrem, l'agulla és un hemisferi d'uns 140 nm de diàmetre (Fig. 1c).Per sota d'això, la punta s'afina en una forma cònica, arribant a una longitud mesurada d'aproximadament 500 nm.Fora de la regió afilada, la punta és cilíndrica i acaba amb una longitud total de punta d'1,18 µm.Aquesta és la part funcional principal de la punta de la sonda.A més, també es va utilitzar una gran sonda esfèrica de poliestirè (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EUA) amb un diàmetre de punta de 45 µm i una constant de molla de 2 N/m per provar com a sonda col·loïdal.amb la sonda PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm per a la comparació.
S'ha informat que el líquid es pot atrapar entre la sonda AFM i l'estructura del raspall de polímer durant la nanoindentació, que exercirà una força ascendent sobre la sonda AFM abans que realment toqui la superfície69.Aquest efecte d'extrusió viscosa a causa de la retenció de fluids pot canviar el punt de contacte aparent, afectant així les mesures del mòdul superficial.Per estudiar l'efecte de la geometria de la sonda i la velocitat de sagnat sobre la retenció de fluids, es van dibuixar corbes de força de sagnat per a mostres de lehfilcon A CL mitjançant una sonda de 140 nm de diàmetre a velocitats de desplaçament constants d'1 µm/s i 2 µm/s.diàmetre de la sonda 45 µm, ajust de força fixa 6 nN aconseguit a 1 µm/s.Es van realitzar experiments amb una sonda de 140 nm de diàmetre a una velocitat de sagnat d'1 µm/s i una força fixada de 300 pN, escollida per crear una pressió de contacte dins del rang fisiològic (1-8 kPa) de la parpella superior.pressió 72. Es van provar mostres toves d'hidrogel PAA amb una pressió d'1 kPa amb una força de sagnat de 50 pN a una velocitat d'1 μm/s utilitzant una sonda amb un diàmetre de 140 nm.
Com que la longitud de la part cònica de la punta de la sonda PFQNM-LC-A-CAL és d'aproximadament 500 nm, per a qualsevol profunditat de sagnat < 500 nm es pot suposar amb seguretat que la geometria de la sonda durant la sagnat es mantindrà fidel a la seva forma de con.A més, s'assumeix que la superfície del material a prova presentarà una resposta elàstica reversible, que també es confirmarà en els apartats següents.Per tant, depenent de la forma i la mida de la punta, vam triar el model d'ajust de con-esfera desenvolupat per Briscoe, Sebastian i Adams, que està disponible al programari del venedor, per processar els nostres experiments de nanoindentació AFM (NanoScope).Programari d'anàlisi de dades de separació, Bruker) 73. El model descriu la relació força-desplaçament F(δ) per a un con amb un defecte a l'àpex esfèric.A la fig.La figura 2 mostra la geometria de contacte durant la interacció d'un con rígid amb una punta esfèrica, on R és el radi de la punta esfèrica, a és el radi de contacte, b és el radi de contacte a l'extrem de la punta esfèrica, δ és el radi de contacte. radi de contacte.profunditat de sagnat, θ és el mig angle del con.La imatge SEM d'aquesta sonda mostra clarament que la punta esfèrica de 140 nm de diàmetre es fusiona tangencialment en un con, de manera que aquí b només es defineix a través de R, és a dir, b = R cos θ.El programari subministrat pel venedor proporciona una relació con-esfera per calcular els valors del mòdul de Young (E) a partir de les dades de separació de força suposant a > b.Relació:
on F és la força de sagnat, E és el mòdul de Young, ν és la relació de Poisson.El radi de contacte a es pot estimar mitjançant:
Esquema de la geometria de contacte d'un con rígid amb una punta esfèrica pressionada en el material d'una lent de contacte Lefilcon amb una capa superficial de raspalls de polímer ramificat.
Si a ≤ b, la relació es redueix a l'equació d'un sagnador esfèric convencional;
Creiem que la interacció de la sonda de sagnat amb l'estructura ramificada del raspall de polímer PMPC farà que el radi de contacte a sigui més gran que el radi de contacte esfèric b.Per tant, per a totes les mesures quantitatives del mòdul elàstic realitzades en aquest estudi, hem utilitzat la dependència obtinguda per al cas a > b.
Els materials biomimètics ultratous estudiats en aquest estudi es van visualitzar de manera exhaustiva mitjançant microscòpia electrònica de transmissió d'escaneig (STEM) de la secció transversal de la mostra i microscòpia de força atòmica (AFM) de la superfície.Aquesta caracterització de la superfície detallada es va realitzar com una extensió del nostre treball publicat anteriorment, en què vam determinar que l'estructura del raspall polimèric ramificat dinàmicament de la superfície de lehfilcon A CL modificada per PMPC presentava propietats mecàniques similars al teixit corneal natiu 14 .Per aquest motiu, ens referim a les superfícies de les lents de contacte com a materials biomimètics14.A la fig.Les figures 3a, b mostren seccions transversals d'estructures de raspall de polímer PMPC ramificats a la superfície d'un substrat de lehfilcon A CL i d'un substrat de SiHy no tractat, respectivament.Les superfícies d'ambdues mostres es van analitzar més amb imatges AFM d'alta resolució, que van confirmar encara més els resultats de l'anàlisi STEM (Fig. 3c, d).En conjunt, aquestes imatges donen una longitud aproximada de l'estructura del raspall de polímer ramificat PMPC a 300-400 nm, que és fonamental per interpretar les mesures de nanoindentació AFM.Una altra observació clau derivada de les imatges és que l'estructura superficial global del material biomimètic CL és morfològicament diferent de la del material del substrat SiHy.Aquesta diferència en la seva morfologia superficial es pot fer evident durant la seva interacció mecànica amb la sonda AFM de sagnat i, posteriorment, en els valors del mòdul mesurats.
Imatges STEM transversals de (a) lehfilcon A CL i (b) substrat SiHy.Barra d'escala, 500 nm.Imatges AFM de la superfície del substrat lehfilcon A CL (c) i del substrat base SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Els polímers bioinspirats i les estructures de raspall de polímer són inherentment suaus i han estat àmpliament estudiats i utilitzats en diverses aplicacions biomèdiques74,75,76,77.Per tant, és important utilitzar el mètode de nanoindentació AFM, que pot mesurar de manera precisa i fiable les seves propietats mecàniques.Però al mateix temps, les propietats úniques d'aquests materials ultratous, com ara un mòdul elàstic extremadament baix, un alt contingut de líquid i una alta elasticitat, sovint dificulten l'elecció del material, la forma i la forma adequats de la sonda de sagnat.mida.Això és important perquè el penetrador no perfora la superfície tova de la mostra, la qual cosa comportaria errors en la determinació del punt de contacte amb la superfície i l'àrea de contacte.
Per això, és essencial una comprensió integral de la morfologia dels materials biomimètics ultratous (lehfilcon A CL).La informació sobre la mida i l'estructura dels raspalls de polímer ramificat obtinguts mitjançant el mètode d'imatge proporciona la base per a la caracterització mecànica de la superfície mitjançant tècniques de nanoindentació AFM.En lloc de sondes col·loïdals esfèriques de mida micres, vam triar la sonda de nitrur de silici PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) amb un diàmetre de punta de 140 nm, especialment dissenyada per al mapeig quantitatiu de les propietats mecàniques de mostres biològiques 78, 79, 80. , 81, 82, 83, 84 La raó de l'ús de sondes relativament agudes en comparació amb les sondes col·loïdals convencionals es pot explicar per les característiques estructurals del material.Comparant la mida de la punta de la sonda (~ 140 nm) amb els raspalls de polímer ramificat a la superfície de CL lehfilcon A, que es mostra a la figura 3a, es pot concloure que la punta és prou gran com per entrar en contacte directe amb aquestes estructures de raspall, que redueix la possibilitat que la punta els travessi.Per il·lustrar aquest punt, a la figura 4 hi ha una imatge STEM del lehfilcon A CL i la punta de sagnat de la sonda AFM (dibuixada a escala).
Esquema que mostra la imatge STEM de lehfilcon A CL i una sonda de sagnat ACM (dibuixada a escala).
A més, la mida de la punta de 140 nm és prou petita per evitar el risc de qualsevol dels efectes d'extrusió enganxosos que s'havien informat anteriorment per als raspalls de polímer produïts pel mètode de nanoindentació CP-AFM69,71.Suposem que, a causa de la forma especial de conos esfèrics i la mida relativament petita d'aquesta punta AFM (Fig. 1), la naturalesa de la corba de força generada per la nanoindentació de lehfilcon A CL no dependrà de la velocitat de sagnat ni de la velocitat de càrrega/descàrrega. .Per tant, no es veu afectat pels efectes poroelàstics.Per provar aquesta hipòtesi, les mostres de lehfilcon A CL es van sagnar amb una força màxima fixa mitjançant una sonda PFQNM-LC-A-CAL, però a dues velocitats diferents, i les corbes de força de tracció i retracció resultants es van utilitzar per representar la força (nN) en separació (µm) es mostra a la figura 5a.És evident que les corbes de força durant la càrrega i la descàrrega se superposen completament, i no hi ha evidència clara que la cisalla de la força a la profunditat de sagnat zero augmenti amb la velocitat de sagnat a la figura, cosa que suggereix que els elements individuals del raspall es van caracteritzar sense efecte poroelàstic.En canvi, els efectes de retenció de fluids (extrusió viscosa i efectes de poroelasticitat) són evidents per a la sonda AFM de 45 µm de diàmetre a la mateixa velocitat de sagnat i es destaquen per la histèresi entre les corbes d'estirament i retracció, tal com es mostra a la figura 5b.Aquests resultats donen suport a la hipòtesi i suggereixen que les sondes de 140 nm de diàmetre són una bona opció per caracteritzar aquestes superfícies toves.
corbes de força de sagnat lehfilcon A CL utilitzant ACM;(a) utilitzant una sonda amb un diàmetre de 140 nm a dues velocitats de càrrega, demostrant l'absència d'efecte poroelàstic durant la sagnació de la superfície;(b) utilitzant sondes amb un diàmetre de 45 µm i 140 nm.s mostren els efectes de l'extrusió viscosa i la poroelasticitat per a sondes grans en comparació amb sondes més petites.
Per caracteritzar superfícies ultratoues, els mètodes de nanoindentació AFM han de tenir la millor sonda per estudiar les propietats del material en estudi.A més de la forma i la mida de la punta, la sensibilitat del sistema detector AFM, la sensibilitat a la deflexió de la punta a l'entorn de prova i la rigidesa del voladís tenen un paper important a l'hora de determinar la precisió i la fiabilitat de la nanoindentació.mesures.Per al nostre sistema AFM, el límit de detecció del detector sensible a la posició (PSD) és d'aproximadament 0,5 mV i es basa en la taxa de molla precalibrada i la sensibilitat de desviació del fluid calculada de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que correspon a la Sensibilitat de càrrega teòrica.és inferior a 0,1 pN.Per tant, aquest mètode permet mesurar una força de sagnat mínima ≤ 0,1 pN sense cap component de soroll perifèric.Tanmateix, és gairebé impossible que un sistema AFM redueixi el soroll perifèric a aquest nivell a causa de factors com la vibració mecànica i la dinàmica de fluids.Aquests factors limiten la sensibilitat global del mètode de nanoindentació AFM i també donen lloc a un senyal de soroll de fons d'aproximadament ≤ 10 pN.Per a la caracterització de la superfície, les mostres de substrat de lehfilcon A CL i SiHy es van sagnar en condicions totalment hidratades mitjançant una sonda de 140 nm per a la caracterització SEM, i les corbes de força resultants es van superposar entre la força (pN) i la pressió.El diagrama de separació (µm) es mostra a la figura 6a.En comparació amb el substrat base de SiHy, la corba de força de lehfilcon A CL mostra clarament una fase de transició que comença al punt de contacte amb el raspall de polímer bifurcat i acaba amb un canvi brusc en el contacte marcant el pendent de la punta amb el material subjacent.Aquesta part de transició de la corba de força destaca el comportament veritablement elàstic del raspall de polímer ramificat a la superfície, com ho demostra la corba de compressió que segueix de prop la corba de tensió i el contrast de les propietats mecàniques entre l'estructura del raspall i el material voluminós SiHy.En comparar lefilcon.Separació de la longitud mitjana d'un raspall de polímer ramificat a la imatge STEM del PCS (Fig. 3a) i la seva corba de força al llarg de l'abscissa de la Fig. 3a.La figura 6a mostra que el mètode és capaç de detectar la punta i el polímer ramificat que arriba a la part superior de la superfície.Contacte entre estructures de raspall.A més, la superposició estreta de les corbes de força no indica cap efecte de retenció de líquids.En aquest cas, no hi ha absolutament cap adhesió entre l'agulla i la superfície de la mostra.Les seccions superiors de les corbes de força de les dues mostres se superposen, reflectint la similitud de les propietats mecàniques dels materials del substrat.
( a ) Corbes de força de nanoindentació AFM per a substrats lehfilcon A CL i substrats SiHy, (b) corbes de força que mostren l'estimació del punt de contacte mitjançant el mètode del llindar del soroll de fons.
Per tal d'estudiar els detalls més petits de la corba de força, la corba de tensió de la mostra de lehfilcon A CL es torna a representar a la figura 6b amb una força màxima de 50 pN al llarg de l'eix y.Aquest gràfic proporciona informació important sobre el soroll de fons original.El soroll està en el rang de ± 10 pN, que s'utilitza per determinar amb precisió el punt de contacte i calcular la profunditat de sagnat.Tal com s'informa a la literatura, la identificació de punts de contacte és fonamental per avaluar amb precisió les propietats dels materials com el mòdul85.Un enfocament que implica el processament automàtic de les dades de la corba de força ha demostrat un millor ajust entre l'ajust de les dades i les mesures quantitatives per a materials tous86.En aquest treball, l'elecció dels punts de contacte és relativament senzilla i objectiva, però té les seves limitacions.El nostre enfocament conservador per determinar el punt de contacte pot donar lloc a valors de mòdul lleugerament sobreestimats per a profunditats de sagnat més petites (< 100 nm).L'ús de la detecció de punts de contacte basat en algorismes i el processament de dades automatitzat podria ser una continuació d'aquest treball en el futur per millorar encara més el nostre mètode.Així, per al soroll de fons intrínsec de l'ordre de ± 10 pN, definim el punt de contacte com el primer punt de dades de l'eix x a la figura 6b amb un valor ≥10 pN.Aleshores, d'acord amb el llindar de soroll de 10 pN, una línia vertical al nivell de ~ 0, 27 µm marca el punt de contacte amb la superfície, després del qual la corba d'estirament continua fins que el substrat assoleix la profunditat de sagnat de ~ 270 nm.Curiosament, segons la mida de les característiques del raspall de polímer ramificat (300-400 nm) mesurades mitjançant el mètode d'imatge, la profunditat de sagnat de la mostra CL lehfilcon A observada mitjançant el mètode del llindar del soroll de fons és d'uns 270 nm, que és molt propera a la mida de mesura amb STEM.Aquests resultats confirmen encara més la compatibilitat i l'aplicabilitat de la forma i la mida de la punta de la sonda AFM per a la sagnat d'aquesta estructura de raspall de polímer ramificat molt suau i altament elàstic.Aquestes dades també proporcionen proves sòlides per donar suport al nostre mètode d'utilitzar el soroll de fons com a llindar per identificar els punts de contacte.Per tant, qualsevol resultat quantitatiu obtingut del modelatge matemàtic i l'ajustament de la corba de força hauria de ser relativament precís.
Les mesures quantitatives mitjançant mètodes de nanoindentació AFM depenen completament dels models matemàtics utilitzats per a la selecció de dades i l'anàlisi posterior.Per tant, és important tenir en compte tots els factors relacionats amb l'elecció del sagnador, les propietats del material i la mecànica de la seva interacció abans d'escollir un model concret.En aquest cas, la geometria de la punta es va caracteritzar acuradament mitjançant micrografies SEM (Fig. 1) i, segons els resultats, la sonda de nanoindentació AFM de 140 nm de diàmetre amb un con dur i una geometria de punta esfèrica és una bona opció per caracteritzar mostres de lehfilcon A CL79. .Un altre factor important que cal avaluar acuradament és l'elasticitat del material polimèric que s'està provant.Tot i que les dades inicials de nanoindentació (Figs. 5a i 6a) descriuen clarament les característiques de la superposició de les corbes de tensió i compressió, és a dir, la recuperació elàstica completa del material, és extremadament important confirmar la naturalesa purament elàstica dels contactes. .Amb aquesta finalitat, es van realitzar dues sagnacions successives al mateix lloc de la superfície de la mostra de lehfilcon A CL a una velocitat de sagnat d'1 µm/s en condicions d'hidratació completa.Les dades de la corba de força resultants es mostren a la fig.7 i, com era d'esperar, les corbes d'expansió i compressió de les dues impressions són gairebé idèntiques, destacant l'elevada elasticitat de l'estructura del raspall de polímer ramificat.
Dues corbes de força de sagnat a la mateixa ubicació a la superfície de lehfilcon A CL indiquen l'elasticitat ideal de la superfície de la lent.
A partir de la informació obtinguda a partir d'imatges SEM i STEM de la punta de la sonda i la superfície de lehfilcon A CL, respectivament, el model de con-esfera és una representació matemàtica raonable de la interacció entre la punta de la sonda AFM i el material de polímer tou que s'està provant.A més, per a aquest model de con-esfera, les hipòtesis fonamentals sobre les propietats elàstiques del material imprès són vàlides per a aquest nou material biomimètic i s'utilitzen per quantificar el mòdul elàstic.
Després d'una avaluació exhaustiva del mètode de nanoindentació AFM i els seus components, incloses les propietats de la sonda de sagnat (forma, mida i rigidesa de la molla), la sensibilitat (estimació del soroll de fons i el punt de contacte) i els models d'ajust de dades (mesures de mòduls quantitatius), el mètode va ser utilitzat.caracteritzar mostres ultratoues disponibles comercialment per verificar resultats quantitatius.Es va provar un hidrogel comercial de poliacrilamida (PAAM) amb un mòdul elàstic d'1 kPa en condicions hidratades mitjançant una sonda de 140 nm.Els detalls de les proves i càlculs dels mòduls es proporcionen a la informació complementària.Els resultats van mostrar que el mòdul mitjà mesurat era de 0,92 kPa i el %RSD i el percentatge (%) de desviació del mòdul conegut eren inferiors al 10%.Aquests resultats confirmen la precisió i la reproductibilitat del mètode de nanoindentació AFM utilitzat en aquest treball per mesurar els mòduls de materials ultratous.Les superfícies de les mostres de lehfilcon A CL i el substrat de base SiHy es van caracteritzar encara més mitjançant el mateix mètode de nanoindentació AFM per estudiar el mòdul de contacte aparent de la superfície ultrasuau en funció de la profunditat de sagnat.Es van generar corbes de separació de la força de sagnat per a tres exemplars de cada tipus (n = 3; una sagnia per mostra) a una força de 300 pN, una velocitat d'1 µm/s i una hidratació completa.La corba de compartició de la força de sagnat es va aproximar mitjançant un model de con-esfera.Per obtenir un mòdul depenent de la profunditat de sagnat, es va establir una part de 40 nm d'amplada de la corba de força a cada increment de 20 nm a partir del punt de contacte i es van mesurar els valors del mòdul a cada pas de la corba de força.Spin Cy et al.S'ha utilitzat un enfocament similar per caracteritzar el gradient de mòdul dels raspalls de polímer de poli (lauril metacrilat) (P12MA) mitjançant nanoindentació de la sonda AFM col·loïdal, i són coherents amb les dades que utilitzen el model de contacte Hertz.Aquest enfocament proporciona una gràfica del mòdul de contacte aparent (kPa) en funció de la profunditat de sagnat (nm), tal com es mostra a la figura 8, que il·lustra el mòdul de contacte aparent / gradient de profunditat.El mòdul elàstic calculat de la mostra CL lehfilcon A es troba en el rang de 2-3 kPa dins dels 100 nm superiors de la mostra, més enllà dels quals comença a augmentar amb la profunditat.D'altra banda, quan es prova el substrat de base SiHy sense una pel·lícula semblant a un pinzell a la superfície, la profunditat màxima de sagnat aconseguida amb una força de 300 pN és inferior a 50 nm i el valor del mòdul obtingut a partir de les dades és d'uns 400 kPa. , que és comparable als valors del mòdul de Young per a materials a granel.
Mòdul de contacte aparent (kPa) vs. profunditat de sagnat (nm) per a substrats de lehfilcon A CL i SiHy mitjançant el mètode de nanoindentació AFM amb geometria de con-esfera per mesurar el mòdul.
La superfície superior de la nova estructura de raspall de polímer ramificat biomimètic presenta un mòdul d'elasticitat extremadament baix (2-3 kPa).Això coincidirà amb l'extrem penjat lliure del raspall de polímer bifurcat tal com es mostra a la imatge STEM.Tot i que hi ha algunes evidències d'un gradient de mòdul a la vora exterior del CL, el substrat principal de mòdul alt és més influent.Tanmateix, els 100 nm superiors de la superfície es troben dins del 20% de la longitud total del raspall de polímer ramificat, per la qual cosa és raonable suposar que els valors mesurats del mòdul en aquest rang de profunditat de sagnat són relativament precisos i no són fortament depèn de l'efecte de l'objecte inferior.
A causa del disseny biomimètic únic de les lents de contacte lehfilcon A, que consisteixen en estructures de raspall de polímer PMPC ramificats empeltats a la superfície dels substrats de SiHy, és molt difícil caracteritzar de manera fiable les propietats mecàniques de les seves estructures superficials mitjançant mètodes de mesura tradicionals.Aquí presentem un mètode avançat de nanoindentació AFM per caracteritzar amb precisió materials ultratous com el lefilcon A amb un alt contingut d'aigua i una elasticitat extremadament alta.Aquest mètode es basa en l'ús d'una sonda AFM la mida de la punta i la geometria de la qual s'escullen acuradament per adaptar-se a les dimensions estructurals de les característiques de la superfície ultra suau que s'han d'imprimir.Aquesta combinació de dimensions entre sonda i estructura proporciona una major sensibilitat, la qual cosa ens permet mesurar el mòdul baix i les propietats elàstiques inherents dels elements de raspall de polímer ramificat, independentment dels efectes poroelàstics.Els resultats van mostrar que els pinzells de polímer PMPC ramificats únics característics de la superfície de la lent tenien un mòdul elàstic extremadament baix (fins a 2 kPa) i una elasticitat molt alta (gairebé el 100%) quan es van provar en un ambient aquós.Els resultats de la nanoindentació AFM també ens van permetre caracteritzar el mòdul de contacte aparent/gradient de profunditat (30 kPa/200 nm) de la superfície de la lent biomimètica.Aquest gradient pot ser degut a la diferència de mòdul entre els raspalls de polímer ramificat i el substrat SiHy, o l'estructura/densitat ramificada dels raspalls de polímer, o una combinació d'aquests.Tanmateix, calen estudis més aprofundits per entendre completament la relació entre estructura i propietats, especialment l'efecte de la ramificació del raspall sobre les propietats mecàniques.Mesures similars poden ajudar a caracteritzar les propietats mecàniques de la superfície d'altres materials ultratous i dispositius mèdics.
Els conjunts de dades generats i/o analitzats durant l'estudi actual estan disponibles als autors respectius a petició raonable.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Reaccions biològiques a les propietats físiques i químiques de les superfícies dels biomaterials.Química.societat.Ed.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Millora de biomaterials d'origen humà per a l'enginyeria de teixits.programació.polímer.la ciència.53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al.Disseny, implementació clínica i resposta immune de biomaterials en medicina regenerativa.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Un mètode millorat per determinar la duresa i el mòdul elàstic mitjançant experiments de sagnat amb mesures de càrrega i desplaçament.J. Alma mater.dipòsit d'emmagatzematge.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Orígens històrics de les proves de duresa de sagnat.Alma mater.la ciència.tecnologies.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Mesures de duresa de sagnat a macro, micro i nanoescala: una revisió crítica.tribu.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Els errors de detecció de superfície condueixen a una sobreestimació del mòdul en la nanoindentació de materials tous.J. Mecha.Comportament.Ciència Biomèdica.Alma mater.2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu.Avaluació del mètode de nanoindentació per a la determinació de les característiques mecàniques de nanocomposites heterogenis mitjançant mètodes experimentals i computacionals.la ciència.Casa 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR i Owart, TS Caracterització mecànica de gels viscoelàstics suaus mitjançant sagnat i anàlisi d'elements finits inversos basat en l'optimització.J. Mecha.Comportament.Ciència Biomèdica.Alma mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optimització de la determinació de la viscoelasticitat mitjançant sistemes de mesura compatibles.Matèria suau 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentation of polymeric surfaces.J. Física.D. Sol·licitar la física.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Caracterització de les propietats mecàniques viscoelàstiques de polímers altament elàstics i teixits biològics mitjançant la indentació de xoc.Revista de Biomaterials.71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Avaluació del mòdul elàstic i el treball d'adhesió de materials tous mitjançant el mètode estès de Borodich-Galanov (BG) i sagnat profunda.pell.Alma mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al.Morfologia a nanoescala i propietats mecàniques de superfícies polimèriques biomimètiques de lents de contacte d'hidrogel de silicona.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).