Tak fordi du besøgte Nature.com.Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.
Viser en karrusel med tre dias på én gang.Brug knapperne Forrige og Næste til at flytte gennem tre dias ad gangen, eller brug skyderknapperne i slutningen til at flytte gennem tre dias ad gangen.
Med udviklingen af ​​nye ultrabløde materialer til medicinsk udstyr og biomedicinske applikationer er den omfattende karakterisering af deres fysiske og mekaniske egenskaber både vigtig og udfordrende.En modificeret atomic force microscopy (AFM) nanoindentationsteknik blev anvendt til at karakterisere det ekstremt lave overflademodul af den nye lehfilcon A biomimetisk silikonehydrogel kontaktlinse belagt med et lag af forgrenede polymerbørstestrukturer.Denne metode tillader præcis bestemmelse af kontaktpunkter uden virkningerne af viskøs ekstrudering, når man nærmer sig forgrenede polymerer.Derudover gør det det muligt at bestemme de mekaniske egenskaber af individuelle børsteelementer uden påvirkning af porelasticitet.Dette opnås ved at vælge en AFM-sonde med et design (spidsstørrelse, geometri og fjederhastighed), der er særligt velegnet til at måle egenskaberne af bløde materialer og biologiske prøver.Denne metode forbedrer følsomheden og nøjagtigheden for nøjagtig måling af det meget bløde materiale lehfilcon A, som har et ekstremt lavt elasticitetsmodul på overfladen (op til 2 kPa) og en ekstrem høj elasticitet i det interne (næsten 100%) vandige miljø .Resultaterne af overfladeundersøgelsen afslørede ikke kun lehfilcon A-linsens ultrabløde overfladeegenskaber, men viste også, at modulet af de forgrenede polymerbørster var sammenligneligt med silicium-hydrogen-substratet.Denne overfladekarakteriseringsteknik kan anvendes på andre ultrabløde materialer og medicinsk udstyr.
De mekaniske egenskaber af materialer designet til direkte kontakt med levende væv er ofte bestemt af det biologiske miljø.Det perfekte match af disse materialeegenskaber hjælper med at opnå de ønskede kliniske egenskaber af materialet uden at forårsage uønskede cellulære reaktioner1,2,3.For homogene bulkmaterialer er karakteriseringen af ​​mekaniske egenskaber relativt let på grund af tilgængeligheden af ​​standardprocedurer og testmetoder (f.eks. mikroindentation4,5,6).For ultrabløde materialer såsom geler, hydrogeler, biopolymerer, levende celler osv., er disse testmetoder dog generelt ikke anvendelige på grund af begrænsninger i måleopløsningen og inhomogeniteten af ​​nogle materialer7.I årenes løb er traditionelle fordybningsmetoder blevet modificeret og tilpasset til at karakterisere en bred vifte af bløde materialer, men mange metoder lider stadig af alvorlige mangler, der begrænser deres anvendelse8,9,10,11,12,13.Manglen på specialiserede testmetoder, der nøjagtigt og pålideligt kan karakterisere de mekaniske egenskaber af superbløde materialer og overfladelag, begrænser deres anvendelse i forskellige applikationer alvorligt.
I vores tidligere arbejde introducerede vi lehfilcon A (CL) kontaktlinsen, et blødt, heterogent materiale med alle de ultrabløde overfladeegenskaber afledt af potentielt biomimetiske designs inspireret af overfladen af ​​øjets hornhinde.Dette biomateriale blev udviklet ved at pode et forgrenet, tværbundet polymerlag af poly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC)) (PMPC) på en silikonehydrogel (SiHy) 15 designet til medicinsk udstyr baseret på.Denne podeproces skaber et lag på overfladen, der består af en meget blød og meget elastisk forgrenet polymerbørstestruktur.Vores tidligere arbejde har bekræftet, at den biomimetiske struktur af lehfilcon A CL giver overlegne overfladeegenskaber såsom forbedret fugt- og begroningsforebyggelse, øget smøreevne og reduceret celle- og bakteriel adhæsion15,16.Derudover tyder brugen og udviklingen af ​​dette biomimetiske materiale også på yderligere udvidelse til andre biomedicinske anordninger.Derfor er det afgørende at karakterisere overfladeegenskaberne af dette ultrabløde materiale og forstå dets mekaniske interaktion med øjet for at skabe en omfattende videnbase til at understøtte fremtidige udviklinger og applikationer.De fleste kommercielt tilgængelige SiHy-kontaktlinser er sammensat af en homogen blanding af hydrofile og hydrofobe polymerer, der danner en ensartet materialestruktur17.Adskillige undersøgelser er blevet udført for at undersøge deres mekaniske egenskaber ved hjælp af traditionelle kompressions-, træk- og mikroindentationstestmetoder18,19,20,21.Imidlertid gør det nye biomimetiske design af lehfilcon A CL det til et unikt heterogent materiale, hvor de mekaniske egenskaber af de forgrenede polymerbørstestrukturer adskiller sig væsentligt fra dem for SiHy-basesubstratet.Derfor er det meget vanskeligt nøjagtigt at kvantificere disse egenskaber ved hjælp af konventionelle og indrykningsmetoder.En lovende metode bruger nanoindentationstestmetoden implementeret i atomkraftmikroskopi (AFM), en metode, der er blevet brugt til at bestemme de mekaniske egenskaber af bløde viskoelastiske materialer såsom biologiske celler og væv samt bløde polymerer22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.I AFM nanoindentation kombineres det grundlæggende i nanoindentationstestning med de seneste fremskridt inden for AFM-teknologi for at give øget målefølsomhed og test af en bred vifte af iboende superbløde materialer31,32,33,34,35,36.Derudover byder teknologien på andre vigtige fordele ved brug af forskellige geometrier.indrykning og sonde og mulighed for test i forskellige flydende medier.
AFM nanoindentation kan betinget opdeles i tre hovedkomponenter: (1) udstyr (sensorer, detektorer, sonder osv.);(2) måleparametre (såsom kraft, forskydning, hastighed, rampestørrelse osv.);(3) Databehandling (grundlinjekorrektion, berøringspunkt-estimering, datatilpasning, modellering osv.).Et væsentligt problem med denne metode er, at flere undersøgelser i litteraturen, der anvender AFM nanoindentation, rapporterer meget forskellige kvantitative resultater for den samme prøve/celle/materialetype37,38,39,40,41.For eksempel har Lekka et al.Indflydelsen af ​​AFM probe geometri på det målte Youngs modul af prøver af mekanisk homogene hydrogel og heterogene celler blev undersøgt og sammenlignet.De rapporterer, at modulværdier er meget afhængige af udkragningsudvælgelse og spidsform, med den højeste værdi for en pyramideformet sonde og den laveste værdi på 42 for en sfærisk sonde.Tilsvarende har Selhuber-Unkel et al.Det er blevet vist, hvordan indenterhastigheden, indenterstørrelsen og tykkelsen af ​​polyacrylamid (PAAM) prøver påvirker Youngs modul målt ved ACM43 nanoindentation.En anden komplicerende faktor er manglen på standard testmaterialer med ekstremt lavt modul og gratis testprocedurer.Dette gør det meget vanskeligt at opnå nøjagtige resultater med tillid.Metoden er imidlertid meget nyttig til relative målinger og sammenlignende evalueringer mellem lignende prøvetyper, for eksempel ved hjælp af AFM nanoindentation til at skelne normale celler fra kræftceller 44, 45 .
Ved test af bløde materialer med AFM nanoindentation er en generel tommelfingerregel at bruge en sonde med en lav fjederkonstant (k), der passer nøje til prøvemodulet og en halvkugleformet/rund spids, så den første sonde ikke gennemborer prøvens overflader på første kontakt med bløde materialer.Det er også vigtigt, at afbøjningssignalet, der genereres af sonden, er stærkt nok til at blive detekteret af laserdetektorsystemet24,34,46,47.I tilfælde af ultrabløde heterogene celler, væv og geler er en anden udfordring at overvinde klæbekraften mellem proben og prøveoverfladen for at sikre reproducerbare og pålidelige målinger48,49,50.Indtil for nylig har det meste arbejde med AFM nanoindentation fokuseret på studiet af den mekaniske adfærd af biologiske celler, væv, geler, hydrogeler og biomolekyler ved hjælp af relativt store sfæriske prober, almindeligvis omtalt som kolloide prober (CP'er)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Disse spidser har en radius på 1 til 50 µm og er almindeligvis fremstillet af borosilikatglas, polymethylmethacrylat (PMMA), polystyren (PS), siliciumdioxid (SiO2) og diamant- som kulstof (DLC).Selvom CP-AFM nanoindentation ofte er det første valg til karakterisering af blød prøve, har den sine egne problemer og begrænsninger.Brugen af ​​store sfæriske spidser af mikronstørrelse øger spidsens samlede kontaktareal med prøven og resulterer i et betydeligt tab af rumlig opløsning.For bløde, inhomogene prøver, hvor de mekaniske egenskaber af lokale elementer kan afvige væsentligt fra gennemsnittet over et større område, kan CP-indrykning skjule enhver inhomogenitet i egenskaber på lokal skala52.Kolloide prober fremstilles typisk ved at fastgøre kolloide kugler i mikronstørrelse til spidsløse cantilevers ved hjælp af epoxyklæbemidler.Selve fremstillingsprocessen er fyldt med mange problemer og kan føre til uoverensstemmelser i probekalibreringsprocessen.Derudover påvirker størrelsen og massen af ​​kolloide partikler direkte de vigtigste kalibreringsparametre for cantileveren, såsom resonansfrekvens, fjederstivhed og afbøjningsfølsomhed56,57,58.Således kan almindeligt anvendte metoder til konventionelle AFM-sonder, såsom temperaturkalibrering, muligvis ikke give en nøjagtig kalibrering for CP, og andre metoder kan være nødvendige for at udføre disse korrektioner57, 59, 60, 61. Typiske CP-indrykningseksperimenter bruger store afvigelser udkraget til studere egenskaberne af bløde prøver, hvilket skaber et andet problem ved kalibrering af cantileverens ikke-lineære opførsel ved relativt store afvigelser62,63,64.Moderne kolloide sondeindrykningsmetoder tager normalt højde for geometrien af ​​den cantilever, der bruges til at kalibrere sonden, men ignorerer påvirkningen af ​​kolloide partikler, hvilket skaber yderligere usikkerhed i metodens nøjagtighed38,61.Tilsvarende er elasticitetsmoduler beregnet ved kontaktmodeltilpasning direkte afhængige af geometrien af ​​fordybningssonden, og uoverensstemmelse mellem spids- og prøveoverfladekarakteristika kan føre til unøjagtigheder27, 65, 66, 67, 68. Nogle nyere arbejde af Spencer et al.De faktorer, der bør tages i betragtning ved karakterisering af bløde polymerbørster ved hjælp af CP-AFM nanoindentationsmetoden, fremhæves.De rapporterede, at tilbageholdelsen af ​​en viskøs væske i polymerbørster som funktion af hastigheden resulterer i en stigning i hovedbelastningen og dermed forskellige målinger af hastighedsafhængige egenskaber30,69,70,71.
I denne undersøgelse har vi karakteriseret overflademodulet af det ultrabløde højelastiske materiale lehfilcon A CL ved hjælp af en modificeret AFM nanoindentationsmetode.I betragtning af egenskaberne og den nye struktur af dette materiale er følsomhedsområdet for den traditionelle indrykningsmetode klart utilstrækkeligt til at karakterisere modulet af dette ekstremt bløde materiale, så det er nødvendigt at bruge en AFM nanoindentationsmetode med højere følsomhed og lavere følsomhed.niveau.Efter at have gennemgået manglerne og problemerne ved eksisterende kolloide AFM-sonde nanoindentationsteknikker, viser vi, hvorfor vi valgte en mindre, specialdesignet AFM-sonde for at eliminere følsomhed, baggrundsstøj, præcist kontaktpunkt, måle hastighedsmodulet af bløde heterogene materialer såsom væskeretention afhængighed.og nøjagtig kvantificering.Derudover var vi i stand til nøjagtigt at måle formen og dimensionerne af fordybningsspidsen, hvilket gjorde det muligt for os at bruge kegle-kugletilpasningsmodellen til at bestemme elasticitetsmodulet uden at vurdere spidsens kontaktareal med materialet.De to implicitte antagelser, der er kvantificeret i dette arbejde, er de fuldt elastiske materialeegenskaber og det indrykningsdybdeuafhængige modul.Ved hjælp af denne metode testede vi først ultrabløde standarder med et kendt modul for at kvantificere metoden, og brugte derefter denne metode til at karakterisere overfladerne på to forskellige kontaktlinsematerialer.Denne metode til at karakterisere AFM nanoindentationsoverflader med øget følsomhed forventes at være anvendelig til en bred vifte af biomimetiske heterogene ultrabløde materialer med potentiel brug i medicinsk udstyr og biomedicinske applikationer.
Lehfilcon A-kontaktlinser (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) og deres silikonehydrogelsubstrater blev valgt til eksperimenter med nanoindentation.Et specialdesignet objektivbeslag blev brugt i eksperimentet.For at installere linsen til test, blev den omhyggeligt placeret på det kuppelformede stativ, idet man sørgede for, at der ikke kom luftbobler ind, og derefter fikseret med kanterne.Et hul i armaturet øverst på linseholderen giver adgang til det optiske center af linsen til nanoindentationseksperimenter, mens væsken holdes på plads.Dette holder linserne fuldt hydreret.500 μl kontaktlinseemballage blev brugt som testopløsning.For at verificere de kvantitative resultater blev kommercielt tilgængelige ikke-aktiveret polyacrylamid (PAAM) hydrogeler fremstillet ud fra en polyacrylamid-co-methylen-bisacrylamid-sammensætning (100 mm Petrisoft petriskåle, Matrigen, Irvine, CA, USA), en kendt elasticitetsmodul på 1 kPa.Brug 4-5 dråber (ca. 125 µl) fosfatbufret saltvand (PBS fra Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) og 1 dråbe OPTI-FREE Puremoist kontaktlinseopløsning (Alcon, Vaud, TX, USA).) ved AFM-hydrogel-probe-grænsefladen.
Prøver af Lehfilcon A CL- og SiHy-substrater blev visualiseret ved hjælp af et FEI Quanta 250 feltemissionsscanningselektronmikroskop (FEG SEM)-system udstyret med en scanningstransmissionselektronmikroskopdetektor (STEM).For at forberede prøverne blev linserne først vasket med vand og skåret i tærteformede skiver.For at opnå en differentiel kontrast mellem de hydrofile og hydrofobe komponenter i prøverne blev en 0,10% stabiliseret opløsning af RuO4 brugt som farvestof, hvori prøverne blev nedsænket i 30 min.Lehfilcon A CL RuO4-farvningen er vigtig ikke kun for at opnå forbedret differentialkontrast, men hjælper også med at bevare strukturen af ​​de forgrenede polymerbørster i deres oprindelige form, som så er synlige på STEM-billeder.De blev derefter vasket og dehydreret i en række ethanol/vand-blandinger med stigende ethanolkoncentration.Prøverne blev derefter støbt med EMBed 812/Araldite epoxy, som hærdede natten over ved 70°C.Prøveblokke opnået ved harpikspolymerisation blev skåret med en ultramikrotom, og de resulterende tynde sektioner blev visualiseret med en STEM-detektor i lavvakuumtilstand ved en accelererende spænding på 30 kV.Det samme SEM-system blev brugt til detaljeret karakterisering af PFQNM-LC-A-CAL AFM-sonden (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA).SEM-billeder af AFM-sonden blev opnået i en typisk højvakuumtilstand med en accelerationsspænding på 30 kV.Få billeder i forskellige vinkler og forstørrelser for at registrere alle detaljerne om formen og størrelsen af ​​AFM-sondespidsen.Alle spidsdimensioner af interesse i billederne blev målt digitalt.
Et Dimension FastScan Bio Icon atomic force-mikroskop (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) med "PeakForce QNM in Fluid"-tilstand blev brugt til at visualisere og nanoindentere lehfilcon A CL, SiHy substrat og PAAm hydrogel prøver.Til billeddannelseseksperimenter blev en PEAKFORCE-HIRS-FA-sonde (Bruker) med en nominel spidsradius på 1 nm brugt til at optage billeder i høj opløsning af prøven ved en scanningshastighed på 0,50 Hz.Alle billeder blev taget i vandig opløsning.
AFM nanoindentationseksperimenter blev udført under anvendelse af en PFQNM-LC-A-CAL-sonde (Bruker).AFM-sonden har en siliciumspids på en nitridudkrager 345 nm tyk, 54 µm lang og 4,5 µm bred med en resonansfrekvens på 45 kHz.Den er specielt designet til at karakterisere og udføre kvantitative nanomekaniske målinger på bløde biologiske prøver.Sensorerne er individuelt kalibreret fra fabrikken med prækalibrerede fjederindstillinger.Fjederkonstanterne for proberne, der blev brugt i denne undersøgelse, var i området 0,05-0,1 N/m.For nøjagtigt at bestemme formen og størrelsen af ​​spidsen blev sonden karakteriseret i detaljer ved hjælp af SEM.På fig.Figur 1a viser et scanningselektronmikrografi med høj opløsning og lav forstørrelse af PFQNM-LC-A-CAL-sonden, hvilket giver et holistisk billede af probedesignet.På fig.1b viser et forstørret billede af toppen af ​​sondespidsen, hvilket giver information om formen og størrelsen af ​​spidsen.I den yderste ende er nålen en halvkugle på ca. 140 nm i diameter (fig. 1c).Under dette tilspidser spidsen til en konisk form og når en målt længde på cirka 500 nm.Uden for det tilspidsede område er spidsen cylindrisk og ender i en samlet spidslængde på 1,18 µm.Dette er den vigtigste funktionelle del af sondespidsen.Derudover blev en stor sfærisk polystyren (PS) sonde (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) med en spidsdiameter på 45 µm og en fjederkonstant på 2 N/m også brugt til test som en kolloid sonde.med PFQNM-LC-A-CAL 140 nm sonde til sammenligning.
Det er blevet rapporteret, at væske kan fanges mellem AFM-sonden og polymerbørstestrukturen under nanoindentation, hvilket vil udøve en opadgående kraft på AFM-sonden, før den faktisk rører overfladen69.Denne viskøse ekstruderingseffekt på grund af væskeretention kan ændre det tilsyneladende kontaktpunkt og derved påvirke overflademodulmålinger.For at studere effekten af ​​sondegeometri og fordybningshastighed på væskeretention blev indtrykningskraftkurver plottet for lehfilcon A CL-prøver under anvendelse af en 140 nm diameter sonde ved konstante forskydningshastigheder på 1 µm/s og 2 µm/s.sondediameter 45 µm, fast kraftindstilling 6 nN opnået ved 1 µm/s.Eksperimenter med en sonde på 140 nm i diameter blev udført ved en indtrykningshastighed på 1 µm/s og en indstillet kraft på 300 pN, valgt for at skabe et kontakttryk inden for det fysiologiske område (1-8 kPa) af det øvre øjenlåg.tryk 72. Bløde færdige prøver af PAA-hydrogel med et tryk på 1 kPa blev testet for en fordybningskraft på 50 pN ved en hastighed på 1 μm/s ved hjælp af en sonde med en diameter på 140 nm.
Da længden af ​​den koniske del af spidsen af ​​PFQNM-LC-A-CAL-sonden er ca. 500 nm, kan det for enhver indrykningsdybde < 500 nm med sikkerhed antages, at geometrien af ​​sonden under indrykning vil forblive tro mod dens kegleform.Derudover antages det, at overfladen af ​​materialet under test vil udvise en reversibel elastisk respons, hvilket også vil blive bekræftet i de følgende afsnit.Afhængigt af spidsens form og størrelse valgte vi derfor kegle-kugletilpasningsmodellen udviklet af Briscoe, Sebastian og Adams, som er tilgængelig i leverandørens software, til at behandle vores AFM nanoindentationseksperimenter (NanoScope).Separationsdataanalysesoftware, Bruker) 73. Modellen beskriver kraft-forskydningsforholdet F(δ) for en kegle med en sfærisk topdefekt.På fig.Figur 2 viser kontaktgeometrien under interaktionen af ​​en stiv kegle med en sfærisk spids, hvor R er radius af den sfæriske spids, a er kontaktradius, b er kontaktradius for enden af ​​den sfæriske spids, δ er kontaktradius.fordybningsdybde, θ er keglens halve vinkel.SEM-billedet af denne sonde viser tydeligt, at den sfæriske spids på 140 nm i diameter smelter tangentielt ind i en kegle, så her er b kun defineret gennem R, dvs. b = R cos θ.Den leverandørleverede software giver et kegle-kugleforhold til at beregne Youngs modulus (E) værdier ud fra kraftadskillelsesdata under antagelse af a > b.Forhold:
hvor F er fordybningskraften, E er Youngs modul, ν er Poissons forhold.Kontaktradius a kan estimeres ved hjælp af:
Skema af kontaktgeometrien af ​​en stiv kegle med en sfærisk spids presset ind i materialet af en Lefilcon kontaktlinse med et overfladelag af forgrenede polymerbørster.
Hvis a ≤ b, reduceres relationen til ligningen for en konventionel sfærisk indenter;
Vi mener, at interaktionen af ​​indrykningssonden med den forgrenede struktur af PMPC-polymerbørsten vil få kontaktradius a til at være større end den sfæriske kontaktradius b.Derfor brugte vi for alle kvantitative målinger af elasticitetsmodulet udført i denne undersøgelse den opnåede afhængighed for tilfældet a > b.
De ultrabløde biomimetiske materialer, der blev undersøgt i denne undersøgelse, blev afbildet omfattende ved hjælp af scanningstransmissionselektronmikroskopi (STEM) af prøvens tværsnit og atomkraftmikroskopi (AFM) af overfladen.Denne detaljerede overfladekarakterisering blev udført som en forlængelse af vores tidligere publicerede arbejde, hvor vi fastslog, at den dynamisk forgrenede polymere børstestruktur af den PMPC-modificerede lehfilcon A CL-overflade udviste lignende mekaniske egenskaber som naturligt hornhindevæv 14 .Af denne grund omtaler vi kontaktlinseoverflader som biomimetiske materialer14.På fig.3a,b viser tværsnit af forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer på overfladen af ​​henholdsvis et lehfilcon A CL-substrat og et ubehandlet SiHy-substrat.Overfladerne af begge prøver blev yderligere analyseret ved hjælp af AFM-billeder i høj opløsning, hvilket yderligere bekræftede resultaterne af STEM-analysen (fig. 3c, d).Tilsammen giver disse billeder en omtrentlig længde af den forgrenede PMPC-polymerbørstestruktur ved 300-400 nm, hvilket er afgørende for fortolkning af AFM-nanoindentationsmålinger.En anden nøgleobservation afledt af billederne er, at den overordnede overfladestruktur af det CL-biomimetiske materiale er morfologisk forskellig fra SiHy-substratmaterialet.Denne forskel i deres overflademorfologi kan blive tydelig under deres mekaniske interaktion med den indrykkede AFM-sonde og efterfølgende i de målte modulværdier.
STEM-billeder i tværsnit af (a) lehfilcon A CL og (b) SiHy-substrat.Målestok, 500 nm.AFM-billeder af overfladen af ​​lehfilcon A CL-substratet (c) og basis SiHy-substratet (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirerede polymerer og polymerbørstestrukturer er i sagens natur bløde og er blevet bredt undersøgt og brugt i forskellige biomedicinske applikationer74,75,76,77.Derfor er det vigtigt at bruge AFM nanoindentationsmetoden, som nøjagtigt og pålideligt kan måle deres mekaniske egenskaber.Men samtidig gør disse ultrabløde materialers unikke egenskaber, såsom ekstremt lavt elasticitetsmodul, højt væskeindhold og høj elasticitet, det ofte svært at vælge det rigtige materiale, form og form på indrykningssonden.størrelse.Dette er vigtigt, så indenteren ikke gennemborer den bløde overflade af prøven, hvilket ville føre til fejl ved bestemmelse af kontaktpunktet med overfladen og kontaktområdet.
Til dette er en omfattende forståelse af morfologien af ​​ultrabløde biomimetiske materialer (lehfilcon A CL) afgørende.Information om størrelsen og strukturen af ​​de forgrenede polymerbørster opnået ved hjælp af billedbehandlingsmetoden giver grundlaget for den mekaniske karakterisering af overfladen ved hjælp af AFM nanoindentationsteknikker.I stedet for sfæriske kolloide prober i mikronstørrelse valgte vi PFQNM-LC-A-CAL siliciumnitridproben (Bruker) med en spidsdiameter på 140 nm, specielt designet til kvantitativ kortlægning af de mekaniske egenskaber af biologiske prøver 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Begrundelsen for at bruge relativt skarpe sonder sammenlignet med konventionelle kolloide sonder kan forklares med materialets strukturelle træk.Ved at sammenligne probespidsstørrelsen (~140 nm) med de forgrenede polymerbørster på overfladen af ​​CL lehfilcon A, vist i fig. 3a, kan det konkluderes, at spidsen er stor nok til at komme i direkte kontakt med disse børstestrukturer, hvilket reducerer chancen for, at spidsen trænger igennem dem.For at illustrere dette punkt er der i fig. 4 et STEM-billede af lehfilcon A CL og den fordybende spids af AFM-sonden (tegnet i skala).
Skematisk, der viser STEM-billede af lehfilcon A CL og en ACM indrykningssonde (tegnet i skala).
Derudover er spidsstørrelsen på 140 nm lille nok til at undgå risikoen for nogen af ​​de klæbrige ekstruderingseffekter, der tidligere er rapporteret for polymerbørster fremstillet ved CP-AFM nanoindentationsmetoden69,71.Vi antager, at på grund af den specielle kegle-sfæriske form og relativt lille størrelse af denne AFM-spids (fig. 1), vil arten af ​​kraftkurven, der genereres af lehfilcon A CL nanoindentation, ikke afhænge af indrykningshastigheden eller på-/tømningshastigheden .Derfor er det ikke påvirket af porelastiske effekter.For at teste denne hypotese blev lehfilcon A CL-prøver indrykket ved en fast maksimal kraft ved hjælp af en PFQNM-LC-A-CAL-sonde, men ved to forskellige hastigheder, og de resulterende træk- og tilbagetrækningskraftkurver blev brugt til at plotte kraften (nN) i adskillelse (µm) er vist i figur 5a.Det er tydeligt, at kraftkurverne under læsning og aflæsning fuldstændig overlapper hinanden, og der er ingen klare beviser for, at kraftforskydningen ved nul indskæringsdybde stiger med indtrykningshastigheden i figuren, hvilket tyder på, at de enkelte børsteelementer var karakteriseret uden en porelastisk effekt.I modsætning hertil er væsketilbageholdelseseffekter (viskøs ekstrudering og porelasticitetseffekter) tydelige for AFM-sonden med en diameter på 45 µm ved samme indtrykningshastighed og fremhæves af hysteresen mellem stræk- og tilbagetrækningskurverne, som vist i figur 5b.Disse resultater understøtter hypotesen og antyder, at sonder med en diameter på 140 nm er et godt valg til at karakterisere sådanne bløde overflader.
lehfilcon A CL-indrykningskraftkurver ved hjælp af ACM;(a) anvendelse af en sonde med en diameter på 140 nm ved to belastningshastigheder, som viser fraværet af en porelastisk effekt under overfladeindskæring;(b) anvendelse af prober med en diameter på 45 µm og 140 nm.s viser virkningerne af viskøs ekstrudering og porelasticitet for store prober sammenlignet med mindre prober.
For at karakterisere ultrabløde overflader skal AFM nanoindentationsmetoder have den bedste sonde til at studere egenskaberne af det materiale, der undersøges.Ud over spidsformen og -størrelsen spiller følsomheden af ​​AFM-detektorsystemet, følsomheden over for spidsafbøjning i testmiljøet og udkragningsstivhed en vigtig rolle i at bestemme nøjagtigheden og pålideligheden af ​​nanoindentation.målinger.For vores AFM-system er detektionsgrænsen for Position Sensitive Detector (PSD) cirka 0,5 mV og er baseret på den prækalibrerede fjederhastighed og den beregnede væskeafbøjningsfølsomhed for PFQNM-LC-A-CAL-sonden, som svarer til teoretisk belastningsfølsomhed.er mindre end 0,1 pN.Derfor tillader denne metode måling af en minimum fordybningskraft ≤ 0,1 pN uden nogen perifer støjkomponent.Det er dog næsten umuligt for et AFM-system at reducere perifer støj til dette niveau på grund af faktorer som mekaniske vibrationer og væskedynamik.Disse faktorer begrænser den overordnede følsomhed af AFM nanoindentationsmetoden og resulterer også i et baggrundsstøjsignal på ca. ≤ 10 pN.Til overfladekarakterisering blev lehfilcon A CL- og SiHy-substratprøver indrykket under fuldt hydrerede betingelser under anvendelse af en 140 nm-sonde til SEM-karakterisering, og de resulterende kraftkurver blev overlejret mellem kraft (pN) og tryk.Separationsdiagrammet (µm) er vist i figur 6a.Sammenlignet med SiHy-basesubstratet viser lehfilcon A CL-kraftkurven tydeligt en overgangsfase, der starter ved kontaktpunktet med den gaffelformede polymerbørste og slutter med en skarp ændring i hældningsmarkeringskontakten af ​​spidsen med det underliggende materiale.Denne overgangsdel af kraftkurven fremhæver den virkelig elastiske opførsel af den forgrenede polymerbørste på overfladen, som det fremgår af kompressionskurven, der nøje følger spændingskurven og kontrasten i mekaniske egenskaber mellem børstestrukturen og det voluminøse SiHy-materiale.Når man sammenligner lefilcon.Adskillelse af den gennemsnitlige længde af en forgrenet polymerbørste i STEM-billedet af PCS (fig. 3a) og dens kraftkurve langs abscissen i fig. 3a.6a viser, at fremgangsmåden er i stand til at detektere spidsen og den forgrenede polymer, der når helt til toppen af ​​overfladen.Kontakt mellem børstestrukturer.Desuden indikerer tæt overlapning af kraftkurverne ingen væsketilbageholdelseseffekt.I dette tilfælde er der absolut ingen adhæsion mellem nålen og overfladen af ​​prøven.De øverste sektioner af kraftkurverne for de to prøver overlapper hinanden, hvilket afspejler ligheden mellem de mekaniske egenskaber af substratmaterialerne.
(a) AFM nanoindentationskraftkurver for lehfilcon A CL-substrater og SiHy-substrater, (b) kraftkurver, der viser kontaktpunktestimering ved brug af baggrundsstøjstærskelmetoden.
For at studere de finere detaljer af kraftkurven er spændingskurven for lehfilcon A CL-prøven genoptegnet i fig. 6b med en maksimal kraft på 50 pN langs y-aksen.Denne graf giver vigtige oplysninger om den oprindelige baggrundsstøj.Støjen er i området ±10 pN, som bruges til nøjagtigt at bestemme kontaktpunktet og beregne indrykningsdybden.Som rapporteret i litteraturen er identifikation af kontaktpunkter afgørende for nøjagtigt at vurdere materialeegenskaber såsom modulus85.En tilgang, der involverer automatisk behandling af kraftkurvedata har vist en forbedret tilpasning mellem datatilpasning og kvantitative målinger for bløde materialer86.I dette arbejde er vores valg af kontaktpunkter relativt enkelt og objektivt, men det har sine begrænsninger.Vores konservative tilgang til bestemmelse af kontaktpunktet kan resultere i let overvurderede modulværdier for mindre fordybningsdybder (< 100 nm).Brugen af ​​algoritmebaseret berøringspunktdetektion og automatiseret databehandling kan være en fortsættelse af dette arbejde i fremtiden for yderligere at forbedre vores metode.For iboende baggrundsstøj i størrelsesordenen ±10 pN definerer vi således kontaktpunktet som det første datapunkt på x-aksen i figur 6b med en værdi på ≥10 pN.Derefter, i overensstemmelse med støjtærsklen på 10 pN, markerer en lodret linje på niveauet ~0,27 µm kontaktpunktet med overfladen, hvorefter strækningskurven fortsætter, indtil substratet når indskæringsdybden på ~270 nm.Interessant nok, baseret på størrelsen af ​​de forgrenede polymerbørstetræk (300-400 nm) målt ved hjælp af billedbehandlingsmetoden, er indrykningsdybden af ​​CL lehfilcon En prøve observeret ved hjælp af baggrundsstøjstærskelmetoden omkring 270 nm, hvilket er meget tæt på målestørrelsen med STEM.Disse resultater bekræfter yderligere kompatibiliteten og anvendeligheden af ​​formen og størrelsen af ​​AFM-sondespidsen til fordybning af denne meget bløde og meget elastiske forgrenede polymerbørstestruktur.Disse data giver også stærke beviser for at understøtte vores metode til at bruge baggrundsstøj som en tærskel for at lokalisere kontaktpunkter.Således bør alle kvantitative resultater opnået fra matematisk modellering og kraftkurvetilpasning være relativt nøjagtige.
Kvantitative målinger med AFM nanoindentation metoder er fuldstændig afhængige af de matematiske modeller, der anvendes til dataudvælgelse og efterfølgende analyse.Derfor er det vigtigt at overveje alle faktorer relateret til valget af indenter, materialeegenskaber og mekanikken i deres interaktion, før du vælger en bestemt model.I dette tilfælde blev spidsgeometrien omhyggeligt karakteriseret ved hjælp af SEM-mikrografer (fig. 1), og baseret på resultaterne er AFM nanoindenting-sonden med en diameter på 140 nm med en hård kegle og sfærisk spidsgeometri et godt valg til karakterisering af lehfilcon A CL79-prøver .En anden vigtig faktor, der skal evalueres omhyggeligt, er elasticiteten af ​​det polymermateriale, der testes.Selvom de indledende data for nanoindentation (fig. 5a og 6a) klart skitserer træk ved overlapningen af ​​spændings- og kompressionskurverne, dvs. den fuldstændige elastiske genvinding af materialet, er det yderst vigtigt at bekræfte kontakternes rent elastiske natur .Til dette formål blev to på hinanden følgende fordybninger udført på samme sted på overfladen af ​​lehfilcon A CL-prøven med en fordybningshastighed på 1 µm/s under fuld hydreringsbetingelser.De resulterende kraftkurvedata er vist i fig.7, og som forventet er ekspansions- og kompressionskurverne for de to print næsten identiske, hvilket fremhæver den høje elasticitet af den forgrenede polymerbørstestruktur.
To fordybningskraftkurver på samme sted på overfladen af ​​lehfilcon A CL angiver den ideelle elasticitet af linseoverfladen.
Baseret på information opnået fra SEM- og STEM-billeder af henholdsvis probespidsen og lehfilcon A CL-overfladen er keglekuglemodellen en rimelig matematisk repræsentation af interaktionen mellem AFM-probespidsen og det bløde polymermateriale, der testes.For denne keglesfære-model gælder desuden de grundlæggende antagelser om det påtrykte materiales elastiske egenskaber for dette nye biomimetiske materiale og bruges til at kvantificere elasticitetsmodulet.
Efter en omfattende evaluering af AFM nanoindentationsmetoden og dens komponenter, herunder indrykningssondens egenskaber (form, størrelse og fjederstivhed), følsomhed (baggrundsstøj og kontaktpunktestimering) og datatilpasningsmodeller (kvantitative modulmålinger), blev metoden Brugt.karakterisere kommercielt tilgængelige ultrabløde prøver for at verificere kvantitative resultater.En kommerciel polyacrylamid (PAAM) hydrogel med et elasticitetsmodul på 1 kPa blev testet under hydratiserede betingelser under anvendelse af en 140 nm probe.Detaljer om modultestning og beregninger findes i de supplerende oplysninger.Resultaterne viste, at det målte gennemsnitsmodul var 0,92 kPa, og %RSD og procentvis (%) afvigelse fra det kendte modul var mindre end 10 %.Disse resultater bekræfter nøjagtigheden og reproducerbarheden af ​​AFM nanoindentationsmetoden, der bruges i dette arbejde til at måle modulerne af ultrabløde materialer.Overfladerne af lehfilcon A CL-prøverne og SiHy-basesubstratet blev yderligere karakteriseret ved hjælp af den samme AFM nanoindentationsmetode for at studere det tilsyneladende kontaktmodul af den ultrabløde overflade som en funktion af indrykningsdybden.Indrykningskraftseparationskurver blev genereret for tre prøver af hver type (n = 3; en fordybning pr. prøve) ved en kraft på 300 pN, en hastighed på 1 µm/s og fuld hydrering.Indrykningskraftdelingskurven blev tilnærmet ved hjælp af en keglekuglemodel.For at opnå et modul afhængigt af indrykningsdybden blev en 40 nm bred del af kraftkurven indstillet ved hvert trin på 20 nm startende fra kontaktpunktet og målte værdier af modulet ved hvert trin af kraftkurven.Spin Cy et al.En lignende tilgang er blevet brugt til at karakterisere modulgradienten af ​​poly(laurylmethacrylat) (P12MA) polymerbørster ved hjælp af kolloid AFM-sonde nanoindentation, og de er i overensstemmelse med data ved hjælp af Hertz-kontaktmodellen.Denne fremgangsmåde giver et plot af tilsyneladende kontaktmodul (kPa) versus indrykningsdybde (nm), som vist i figur 8, som illustrerer den tilsyneladende kontaktmodul/dybdegradient.Det beregnede elasticitetsmodul for CL lehfilcon A-prøven er i området 2-3 kPa inden for de øverste 100 nm af prøven, ud over hvilken den begynder at stige med dybden.På den anden side, når man tester SiHy-basissubstratet uden en børstelignende film på overfladen, er den maksimale fordybningsdybde opnået ved en kraft på 300 pN mindre end 50 nm, og modulværdien opnået fra dataene er ca. 400 kPa , hvilket er sammenligneligt med værdierne af Youngs modul for bulkmaterialer.
Tilsyneladende kontaktmodul (kPa) vs. indrykningsdybde (nm) for lehfilcon A CL og SiHy substrater ved brug af AFM nanoindentationsmetode med keglekuglegeometri til måling af modul.
Den øverste overflade af den nye biomimetiske forgrenede polymerbørstestruktur udviser et ekstremt lavt elasticitetsmodul (2-3 kPa).Dette vil matche den frithængende ende af den gaffelformede polymerbørste som vist på STEM-billedet.Mens der er nogle tegn på en modulgradient ved den ydre kant af CL, er det vigtigste højmodulsubstrat mere indflydelsesrigt.Imidlertid er de øverste 100 nm af overfladen inden for 20 % af den samlede længde af den forgrenede polymerbørste, så det er rimeligt at antage, at de målte værdier af modulet i dette indrykningsdybdeområde er relativt nøjagtige og ikke er stærkt afhænge af effekten af ​​det nederste objekt.
På grund af det unikke biomimetiske design af lehfilcon A-kontaktlinser, bestående af forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer podet på overfladen af ​​SiHy-substrater, er det meget vanskeligt pålideligt at karakterisere de mekaniske egenskaber af deres overfladestrukturer ved hjælp af traditionelle målemetoder.Her præsenterer vi en avanceret AFM nanoindentationsmetode til præcis karakterisering af ultrabløde materialer som lefilcon A med højt vandindhold og ekstrem høj elasticitet.Denne metode er baseret på brugen af ​​en AFM-sonde, hvis spidsstørrelse og geometri er omhyggeligt udvalgt til at matche de strukturelle dimensioner af de ultrabløde overfladeegenskaber, der skal præges.Denne kombination af dimensioner mellem sonde og struktur giver øget følsomhed, hvilket giver os mulighed for at måle det lave modul og de iboende elastiske egenskaber af forgrenede polymerbørsteelementer, uanset porelastiske effekter.Resultaterne viste, at de unikke forgrenede PMPC-polymerbørster, der er karakteristiske for linseoverfladen, havde et ekstremt lavt elasticitetsmodul (op til 2 kPa) og meget høj elasticitet (næsten 100%), når de blev testet i et vandigt miljø.Resultaterne af AFM nanoindentation tillod os også at karakterisere den tilsyneladende kontaktmodul/dybdegradient (30 kPa/200 nm) af den biomimetiske linseoverflade.Denne gradient kan skyldes modulforskellen mellem de forgrenede polymerbørster og SiHy-substratet eller polymerbørsternes forgrenede struktur/densitet eller en kombination deraf.Der er dog behov for yderligere dybdegående undersøgelser for fuldt ud at forstå sammenhængen mellem struktur og egenskaber, især effekten af ​​børsteforgrening på mekaniske egenskaber.Lignende målinger kan hjælpe med at karakterisere de mekaniske egenskaber af overfladen af ​​andre ultrabløde materialer og medicinsk udstyr.
Datasæt genereret og/eller analyseret i løbet af den aktuelle undersøgelse er tilgængelige fra de respektive forfattere efter rimelig anmodning.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. og Haugen, HJ Biologiske reaktioner på fysiske og kemiske egenskaber af overflader af biomaterialer.Kemisk.samfund.Ed.49, 5178-5224 (2020).
Chen, FM og Liu, X. Forbedring af humant afledte biomaterialer til vævsteknologi.programmering.polymer.videnskaben.53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al.Design, klinisk implementering og immunrespons af biomaterialer i regenerativ medicin.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK og Farr GM En forbedret metode til at bestemme hårdhed og elasticitetsmodul ved hjælp af indrykningsforsøg med belastnings- og forskydningsmålinger.J. Alma mater.opbevaringstank.7, 1564-1583 (2011).
Wally, SM Historisk oprindelse af indrykningshårdhedstestning.Alma Mater.videnskaben.teknologier.28, 1028-1044 (2012).
Broitman, E. Indrykningshårdhedsmålinger på makro-, mikro- og nanoskala: En kritisk gennemgang.stamme.Wright.65, 1-18 (2017).
Kaufman, JD og Clapperich, SM Overfladedetekteringsfejl fører til moduloverestimering ved nanoindentation af bløde materialer.J. Mecha.Opførsel.Biomedicinsk Videnskab.Alma Mater.2, 312-317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR og Yahya M.Yu.Evaluering af nanoindentationsmetoden til bestemmelse af de mekaniske karakteristika af heterogene nanokompositter ved hjælp af eksperimentelle og beregningsmetoder.videnskaben.Hus 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR og Owart, TS Mekanisk karakterisering af bløde viskoelastiske geler ved indrykning og optimeringsbaseret invers finite element-analyse.J. Mecha.Opførsel.Biomedicinsk Videnskab.Alma Mater.2, 355-363 (2009).
Andrews JW, Bowen J og Chaneler D. Optimering af viskoelasticitetsbestemmelse ved hjælp af kompatible målesystemer.Soft Matter 9, 5581-5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. og Pellillo, E. Nanoindentation af polymere overflader.J. Fysik.D. Ansøg om fysik.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. og Van Vliet KJ Karakterisering af viskoelastiske mekaniske egenskaber af højelastiske polymerer og biologiske væv ved hjælp af stødindrykning.Journal of Biomaterials.71, 388-397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluering af elasticitetsmodulet og vedhæftningsarbejdet af bløde materialer ved hjælp af den udvidede Borodich-Galanov (BG) metode og dyb indrykning.pels.Alma Mater.129, 198-213 (2019).
Shi, X. et al.Nanoskala morfologi og mekaniske egenskaber af biomimetiske polymere overflader af silikone hydrogel kontaktlinser.Langmuir 37, 13961-13967 (2021).