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Con lo sviluppo di nuovi materiali ultra morbidi per dispositivi medici e applicazioni biomediche, la caratterizzazione completa delle loro proprietà fisiche e meccaniche è importante e impegnativa.Una tecnica di nanoindentazione con microscopia a forza atomica (AFM) modificata è stata applicata per caratterizzare il modulo superficiale estremamente basso della nuova lente a contatto in idrogel di silicone biomimetico lehfilcon A rivestita con uno strato di strutture a pennello polimeriche ramificate.Questo metodo consente la determinazione precisa dei punti di contatto senza gli effetti dell'estrusione viscosa quando si avvicinano polimeri ramificati.Inoltre consente di determinare le caratteristiche meccaniche dei singoli elementi della spazzola senza l'effetto della poroelasticità.Ciò si ottiene selezionando una sonda AFM con un design (dimensione della punta, geometria e rigidità della molla) particolarmente adatto per misurare le proprietà di materiali morbidi e campioni biologici.Questo metodo migliora la sensibilità e l'accuratezza per una misurazione accurata del materiale molto morbido lehfilcon A, che ha un modulo di elasticità estremamente basso sulla superficie (fino a 2 kPa) e un'elasticità estremamente elevata nell'ambiente acquoso interno (quasi il 100%) .I risultati dello studio della superficie non solo hanno rivelato le proprietà superficiali ultra morbide della lente lehfilcon A, ma hanno anche dimostrato che il modulo delle spazzole polimeriche ramificate era paragonabile a quello del substrato di silicio-idrogeno.Questa tecnica di caratterizzazione superficiale può essere applicata ad altri materiali ultra morbidi e dispositivi medici.
Le proprietà meccaniche dei materiali progettati per il contatto diretto con i tessuti viventi sono spesso determinate dall'ambiente biologico.La perfetta corrispondenza di queste proprietà del materiale aiuta a ottenere le caratteristiche cliniche desiderate del materiale senza causare risposte cellulari avverse1,2,3.Per materiali omogenei sfusi, la caratterizzazione delle proprietà meccaniche è relativamente semplice grazie alla disponibilità di procedure standard e metodi di prova (ad esempio, microindentazione4,5,6).Tuttavia, per materiali ultra morbidi come gel, idrogel, biopolimeri, cellule viventi, ecc., questi metodi di prova generalmente non sono applicabili a causa delle limitazioni della risoluzione di misurazione e della disomogeneità di alcuni materiali7.Nel corso degli anni, i metodi di indentazione tradizionali sono stati modificati e adattati per caratterizzare un’ampia gamma di materiali morbidi, ma molti metodi soffrono ancora di gravi carenze che ne limitano l’utilizzo8,9,10,11,12,13.La mancanza di metodi di prova specializzati in grado di caratterizzare in modo accurato e affidabile le proprietà meccaniche dei materiali super morbidi e degli strati superficiali ne limita fortemente l'uso in varie applicazioni.
Nel nostro lavoro precedente, abbiamo introdotto la lente a contatto lehfilcon A (CL), un materiale morbido eterogeneo con tutte le proprietà superficiali ultra morbide derivate da design potenzialmente biomimetici ispirati alla superficie della cornea dell'occhio.Questo biomateriale è stato sviluppato innestando uno strato polimerico ramificato e reticolato di poli(2-metacriloilossietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) su un idrogel siliconico (SiHy) 15 progettato per dispositivi medici basati su.Questo processo di innesto crea uno strato in superficie costituito da una struttura a pennello polimerico ramificato molto morbida e altamente elastica.Il nostro lavoro precedente ha confermato che la struttura biomimetica di lehfilcon A CL fornisce proprietà superficiali superiori come una migliore prevenzione della bagnatura e delle incrostazioni, una maggiore lubrificazione e una ridotta adesione cellulare e batterica15,16.Inoltre, l’uso e lo sviluppo di questo materiale biomimetico suggeriscono anche un’ulteriore espansione ad altri dispositivi biomedici.Pertanto, è fondamentale caratterizzare le proprietà superficiali di questo materiale ultra morbido e comprenderne l’interazione meccanica con l’occhio al fine di creare una base di conoscenze completa per supportare sviluppi e applicazioni futuri.La maggior parte delle lenti a contatto SiHy disponibili in commercio sono composte da una miscela omogenea di polimeri idrofili e idrofobi che formano una struttura materiale uniforme17.Sono stati condotti numerosi studi per indagare le loro proprietà meccaniche utilizzando metodi tradizionali di prova di compressione, trazione e microindentazione18,19,20,21.Tuttavia, il nuovo design biomimetico di lehfilcon A CL lo rende un materiale eterogeneo unico in cui le proprietà meccaniche delle strutture ramificate della spazzola polimerica differiscono significativamente da quelle del substrato di base SiHy.Pertanto, è molto difficile quantificare accuratamente queste proprietà utilizzando metodi convenzionali e di indentazione.Un metodo promettente utilizza il metodo di test della nanoindentazione implementato nella microscopia a forza atomica (AFM), un metodo che è stato utilizzato per determinare le proprietà meccaniche di materiali viscoelastici morbidi come cellule e tessuti biologici, nonché polimeri morbidi22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.Nella nanoindentazione AFM, i fondamenti dei test di nanoindentazione sono combinati con i più recenti progressi nella tecnologia AFM per fornire una maggiore sensibilità di misurazione e test di un'ampia gamma di materiali intrinsecamente super morbidi31,32,33,34,35,36.Inoltre, la tecnologia offre altri importanti vantaggi attraverso l’utilizzo di diverse geometrie.penetratore e sonda e possibilità di effettuare test in vari mezzi liquidi.
La nanoindentazione AFM può essere suddivisa condizionatamente in tre componenti principali: (1) apparecchiature (sensori, rilevatori, sonde, ecc.);(2) parametri di misurazione (quali forza, spostamento, velocità, dimensione della rampa, ecc.);(3) Elaborazione dei dati (correzione della linea di base, stima del punto di contatto, adattamento dei dati, modellazione, ecc.).Un problema significativo con questo metodo è che diversi studi in letteratura che utilizzano la nanoindentazione AFM riportano risultati quantitativi molto diversi per lo stesso tipo di campione/cella/materiale37,38,39,40,41.Ad esempio, Lekka et al.È stata studiata e confrontata l'influenza della geometria della sonda AFM sul modulo di Young misurato di campioni di idrogel meccanicamente omogeneo e cellule eterogenee.Riferiscono che i valori del modulo dipendono fortemente dalla selezione del cantilever e dalla forma della punta, con il valore più alto per una sonda a forma piramidale e il valore più basso di 42 per una sonda sferica.Allo stesso modo, Selhuber-Unkel et al.È stato dimostrato come la velocità del penetratore, la dimensione del penetratore e lo spessore dei campioni di poliacrilammide (PAAM) influenzino il modulo di Young misurato mediante nanoindentazione ACM43.Un altro fattore complicante è la mancanza di materiali di prova standard a modulo estremamente basso e di procedure di prova gratuite.Ciò rende molto difficile ottenere risultati accurati con sicurezza.Tuttavia, il metodo è molto utile per misurazioni relative e valutazioni comparative tra tipi di campioni simili, ad esempio utilizzando la nanoindentazione AFM per distinguere le cellule normali dalle cellule tumorali 44, 45.
Quando si testano materiali morbidi con nanoindentazione AFM, una regola pratica generale è quella di utilizzare una sonda con una costante elastica bassa (k) che corrisponda strettamente al modulo del campione e una punta emisferica/rotonda in modo che la prima sonda non perfori le superfici del campione su primo contatto con materiali morbidi.È anche importante che il segnale di deflessione generato dalla sonda sia sufficientemente forte da essere rilevato dal sistema di rilevamento laser24,34,46,47.Nel caso di cellule, tessuti e gel eterogenei ultra morbidi, un'altra sfida è superare la forza adesiva tra la sonda e la superficie del campione per garantire misurazioni riproducibili e affidabili48,49,50.Fino a poco tempo fa, la maggior parte del lavoro sulla nanoindentazione AFM si concentrava sullo studio del comportamento meccanico di cellule biologiche, tessuti, gel, idrogel e biomolecole utilizzando sonde sferiche relativamente grandi, comunemente denominate sonde colloidali (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Queste punte hanno un raggio da 1 a 50 µm e sono comunemente realizzate in vetro borosilicato, polimetilmetacrilato (PMMA), polistirene (PS), biossido di silicio (SiO2) e diamante- come il carbonio (DLC).Sebbene la nanoindentazione CP-AFM sia spesso la prima scelta per la caratterizzazione dei campioni morbidi, presenta problemi e limiti.L'uso di punte sferiche di grandi dimensioni, di dimensioni micron, aumenta l'area di contatto totale della punta con il campione e comporta una significativa perdita di risoluzione spaziale.Per campioni morbidi e disomogenei, dove le proprietà meccaniche degli elementi locali possono differire significativamente dalla media su un'area più ampia, l'indentazione CP può nascondere qualsiasi disomogeneità nelle proprietà su scala locale52.Le sonde colloidali vengono generalmente realizzate attaccando sfere colloidali di dimensioni micron a cantilever senza punta utilizzando adesivi epossidici.Il processo di produzione stesso è irto di molti problemi e può portare a incoerenze nel processo di calibrazione della sonda.Inoltre, la dimensione e la massa delle particelle colloidali influenzano direttamente i principali parametri di calibrazione del cantilever, come la frequenza di risonanza, la rigidità della molla e la sensibilità alla deflessione56,57,58.Pertanto, i metodi comunemente utilizzati per le sonde AFM convenzionali, come la calibrazione della temperatura, potrebbero non fornire una calibrazione accurata per CP e potrebbero essere necessari altri metodi per eseguire queste correzioni57, 59, 60, 61. Gli esperimenti tipici di indentazione CP utilizzano grandi deviazioni cantilever per studiare le proprietà dei campioni morbidi, il che crea un altro problema quando si calibra il comportamento non lineare del cantilever a deviazioni relativamente grandi62,63,64.I moderni metodi di indentazione della sonda colloidale solitamente tengono conto della geometria del cantilever utilizzato per calibrare la sonda, ma ignorano l'influenza delle particelle colloidali, il che crea ulteriore incertezza nell'accuratezza del metodo38,61.Allo stesso modo, i moduli elastici calcolati mediante l'adattamento del modello di contatto dipendono direttamente dalla geometria della sonda di indentazione e la mancata corrispondenza tra le caratteristiche della punta e della superficie del campione può portare a imprecisioni27, 65, 66, 67, 68. Alcuni lavori recenti di Spencer et al.Vengono evidenziati i fattori che dovrebbero essere presi in considerazione quando si caratterizzano le spazzole in polimero morbido utilizzando il metodo di nanoindentazione CP-AFM.Hanno riferito che la ritenzione di un fluido viscoso nelle spazzole polimeriche in funzione della velocità determina un aumento del carico sulla testa e quindi misurazioni diverse delle proprietà dipendenti dalla velocità30,69,70,71.
In questo studio, abbiamo caratterizzato il modulo superficiale del materiale ultra morbido e altamente elastico lehfilcon A CL utilizzando un metodo di nanoindentazione AFM modificato.Date le proprietà e la nuova struttura di questo materiale, l'intervallo di sensibilità del metodo di indentazione tradizionale è chiaramente insufficiente per caratterizzare il modulo di questo materiale estremamente morbido, quindi è necessario utilizzare un metodo di nanoindentazione AFM con sensibilità maggiore e sensibilità inferiore.livello.Dopo aver esaminato le carenze e i problemi delle attuali tecniche di nanoindentazione della sonda AFM colloidale, mostriamo perché abbiamo scelto una sonda AFM più piccola e progettata su misura per eliminare sensibilità, rumore di fondo, punto di contatto preciso e misurare il modulo di velocità di materiali morbidi eterogenei come la ritenzione di liquidi dipendenza.e quantificazione accurata.Inoltre, siamo stati in grado di misurare con precisione la forma e le dimensioni della punta di indentazione, permettendoci di utilizzare il modello di adattamento cono-sfera per determinare il modulo di elasticità senza valutare l'area di contatto della punta con il materiale.Le due ipotesi implicite quantificate in questo lavoro sono le proprietà del materiale completamente elastico e il modulo di indentazione indipendente dalla profondità.Utilizzando questo metodo, abbiamo prima testato standard ultra-morbidi con un modulo noto per quantificare il metodo, quindi abbiamo utilizzato questo metodo per caratterizzare le superfici di due diversi materiali per lenti a contatto.Si prevede che questo metodo di caratterizzazione delle superfici di nanoindentazione AFM con maggiore sensibilità sarà applicabile a un'ampia gamma di materiali ultrasoft eterogenei biomimetici con potenziale utilizzo in dispositivi medici e applicazioni biomediche.
Le lenti a contatto Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) e i loro substrati di idrogel di silicone sono stati scelti per gli esperimenti di nanoindentazione.Nell'esperimento è stato utilizzato un innesto per obiettivo appositamente progettato.Per installare l'obiettivo per il test, è stato posizionato con cura sul supporto a forma di cupola, assicurandosi che non entrassero bolle d'aria, e quindi fissato con i bordi.Un foro nel dispositivo nella parte superiore del supporto della lente fornisce l'accesso al centro ottico della lente per esperimenti di nanoindentazione mantenendo il liquido in posizione.Ciò mantiene le lenti completamente idratate.Come soluzione di prova sono stati utilizzati 500 μl di soluzione per il confezionamento di lenti a contatto.Per verificare i risultati quantitativi, sono stati preparati idrogel di poliacrilammide non attivato (PAAM) disponibili in commercio da una composizione di poliacrilammide-cometilene-bisacrilammide (piastre Petrisoft Petri da 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, USA), un modulo elastico noto di 1 kPa.Utilizzare 4-5 gocce (circa 125 µl) di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS di Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) e 1 goccia di soluzione per lenti a contatto OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA).) all'interfaccia idrogel-sonda AFM.
Campioni di substrati Lehfilcon A CL e SiHy sono stati visualizzati utilizzando un sistema di microscopio elettronico a scansione a emissione di campo FEI Quanta 250 (FEG SEM) dotato di un rilevatore di microscopio elettronico a trasmissione di scansione (STEM).Per preparare i campioni, le lenti sono state prima lavate con acqua e tagliate a spicchi a forma di torta.Per ottenere un contrasto differenziale tra le componenti idrofile e idrofobe dei campioni, come colorante è stata utilizzata una soluzione stabilizzata allo 0,10% di RuO4, in cui i campioni sono stati immersi per 30 minuti.La colorazione lehfilcon A CL RuO4 è importante non solo per ottenere un migliore contrasto differenziale, ma aiuta anche a preservare la struttura delle spazzole polimeriche ramificate nella loro forma originale, che sono poi visibili sulle immagini STEM.Sono stati poi lavati e disidratati in una serie di miscele etanolo/acqua con concentrazione crescente di etanolo.I campioni sono stati poi colati con la resina epossidica EMBed 812/Araldite, che ha indurito durante la notte a 70°C.I blocchi campione ottenuti mediante polimerizzazione della resina sono stati tagliati con un ultramicrotomo e le sezioni sottili risultanti sono state visualizzate con un rilevatore STEM in modalità basso vuoto con una tensione di accelerazione di 30 kV.Lo stesso sistema SEM è stato utilizzato per la caratterizzazione dettagliata della sonda AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA).Le immagini SEM della sonda AFM sono state ottenute in una tipica modalità di alto vuoto con una tensione di accelerazione di 30 kV.Acquisisci immagini a diversi angoli e ingrandimenti per registrare tutti i dettagli della forma e delle dimensioni della punta della sonda AFM.Tutte le dimensioni della punta di interesse nelle immagini sono state misurate digitalmente.
Un microscopio a forza atomica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) con la modalità "PeakForce QNM in Fluid" è stato utilizzato per visualizzare e nanoindentare campioni di lehfilcon A CL, substrato SiHy e idrogel PAAm.Per gli esperimenti di imaging, è stata utilizzata una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) con un raggio nominale della punta di 1 nm per acquisire immagini ad alta risoluzione del campione a una velocità di scansione di 0,50 Hz.Tutte le immagini sono state scattate in soluzione acquosa.
Gli esperimenti di nanoindentazione AFM sono stati condotti utilizzando una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).La sonda AFM ha una punta in silicio su un cantilever in nitruro spesso 345 nm, lungo 54 µm e largo 4,5 µm con una frequenza di risonanza di 45 kHz.È specificamente progettato per caratterizzare ed eseguire misurazioni nanomeccaniche quantitative su campioni biologici morbidi.I sensori sono calibrati individualmente in fabbrica con impostazioni della molla precalibrate.Le costanti elastiche delle sonde utilizzate in questo studio erano comprese tra 0,05 e 0,1 N/m.Per determinare con precisione la forma e la dimensione della punta, la sonda è stata caratterizzata in dettaglio utilizzando il SEM.Nella fig.La Figura 1a mostra una micrografia elettronica a scansione ad alta risoluzione e basso ingrandimento della sonda PFQNM-LC-A-CAL, che fornisce una visione olistica del design della sonda.Nella fig.1b mostra una vista ingrandita della parte superiore della punta della sonda, fornendo informazioni sulla forma e le dimensioni della punta.All'estremità estrema, l'ago è un emisfero di circa 140 nm di diametro (Fig. 1c).Al di sotto di questo, la punta si assottiglia in una forma conica, raggiungendo una lunghezza misurata di circa 500 nm.All'esterno della regione rastremata, la punta è cilindrica e termina con una lunghezza totale della punta di 1,18 µm.Questa è la parte funzionale principale della punta della sonda.Inoltre, per il test come sonda colloidale è stata utilizzata anche una grande sonda sferica in polistirene (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) con un diametro della punta di 45 µm e una costante elastica di 2 N/m.con sonda PFQNM-LC-A-CAL da 140 nm per confronto.
È stato riferito che il liquido può rimanere intrappolato tra la sonda AFM e la struttura della spazzola polimerica durante la nanoindentazione, che eserciterà una forza verso l'alto sulla sonda AFM prima che tocchi effettivamente la superficie69.Questo effetto di estrusione viscoso dovuto alla ritenzione di liquidi può modificare il punto di contatto apparente, influenzando così le misurazioni del modulo superficiale.Per studiare l'effetto della geometria della sonda e della velocità di indentazione sulla ritenzione di liquidi, sono state tracciate curve di forza di indentazione per campioni di lehfilcon A CL utilizzando una sonda da 140 nm di diametro a velocità di spostamento costanti di 1 µm/s e 2 µm/s.diametro sonda 45 µm, impostazione forza fissa 6 nN raggiunta a 1 µm/s.Gli esperimenti con una sonda di 140 nm di diametro sono stati condotti ad una velocità di indentazione di 1 µm/s e una forza impostata di 300 pN, scelta per creare una pressione di contatto entro l'intervallo fisiologico (1–8 kPa) della palpebra superiore.pressione 72. Campioni morbidi già pronti di idrogel PAA con una pressione di 1 kPa sono stati testati per una forza di indentazione di 50 pN a una velocità di 1 μm/s utilizzando una sonda con un diametro di 140 nm.
Poiché la lunghezza della parte conica della punta della sonda PFQNM-LC-A-CAL è di circa 500 nm, per qualsiasi profondità di indentazione < 500 nm si può presumere con sicurezza che la geometria della sonda durante l'indentazione rimarrà fedele alla sua forma di cono.Inoltre, si presuppone che la superficie del materiale in prova presenti una risposta elastica reversibile, che verrà confermata anche nelle sezioni successive.Pertanto, a seconda della forma e delle dimensioni della punta, abbiamo scelto il modello di adattamento cono-sfera sviluppato da Briscoe, Sebastian e Adams, disponibile nel software del fornitore, per elaborare i nostri esperimenti di nanoindentazione AFM (NanoScope).Software di analisi dei dati di separazione, Bruker) 73. Il modello descrive la relazione forza-spostamento F(δ) per un cono con un difetto all'apice sferico.Nella fig.La Figura 2 mostra la geometria del contatto durante l'interazione di un cono rigido con una punta sferica, dove R è il raggio della punta sferica, a è il raggio di contatto, b è il raggio di contatto all'estremità della punta sferica, δ è il raggio di contatto.profondità di rientranza, θ è il semiangolo del cono.L'immagine SEM di questa sonda mostra chiaramente che la punta sferica di 140 nm di diametro si fonde tangenzialmente in un cono, quindi qui b è definito solo tramite R, cioè b = R cos θ.Il software fornito dal fornitore fornisce una relazione cono-sfera per calcolare i valori del modulo di Young (E) dai dati di separazione della forza presupponendo a > b.Relazione:
dove F è la forza di indentazione, E è il modulo di Young, ν è il rapporto di Poisson.Il raggio di contatto a può essere stimato utilizzando:
Schema della geometria del contatto di un cono rigido con punta sferica pressato nel materiale di una lente a contatto Lefilcon con uno strato superficiale di spazzole polimeriche ramificate.
Se a ≤ b, la relazione si riduce all'equazione per un penetratore sferico convenzionale;
Riteniamo che l'interazione della sonda di indentazione con la struttura ramificata della spazzola polimerica PMPC farà sì che il raggio di contatto a sia maggiore del raggio di contatto sferico b.Pertanto, per tutte le misurazioni quantitative del modulo elastico eseguite in questo studio, abbiamo utilizzato la dipendenza ottenuta per il caso a > b.
I materiali biomimetici ultrasoft studiati in questo studio sono stati ripresi in modo completo utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione (STEM) della sezione trasversale del campione e la microscopia a forza atomica (AFM) della superficie.Questa caratterizzazione superficiale dettagliata è stata eseguita come estensione del nostro lavoro precedentemente pubblicato, in cui abbiamo determinato che la struttura a pennello polimerico ramificata dinamicamente della superficie lehfilcon A CL modificata con PMPC mostrava proprietà meccaniche simili al tessuto corneale nativo 14.Per questo motivo chiamiamo superfici delle lenti a contatto materiali biomimetici14.Nella fig.3a,b mostrano sezioni trasversali di strutture ramificate di spazzole polimeriche PMPC sulla superficie di un substrato lehfilcon A CL e un substrato SiHy non trattato, rispettivamente.Le superfici di entrambi i campioni sono state ulteriormente analizzate utilizzando immagini AFM ad alta risoluzione, che hanno confermato ulteriormente i risultati dell'analisi STEM (Fig. 3c, d).Nel loro insieme, queste immagini forniscono una lunghezza approssimativa della struttura della spazzola polimerica ramificata PMPC a 300-400 nm, che è fondamentale per interpretare le misurazioni della nanoindentazione AFM.Un'altra osservazione chiave derivata dalle immagini è che la struttura superficiale complessiva del materiale biomimetico CL è morfologicamente diversa da quella del materiale substrato SiHy.Questa differenza nella loro morfologia superficiale può diventare evidente durante la loro interazione meccanica con la sonda AFM e successivamente nei valori del modulo misurati.
Immagini STEM in sezione trasversale di (a) lehfilcon A CL e (b) substrato SiHy.Barra della scala, 500 nm.Immagini AFM della superficie del substrato lehfilcon A CL (c) e del substrato SiHy di base (d) (3 µm × 3 µm).
I polimeri bioispirati e le strutture a spazzola polimerica sono intrinsecamente morbidi e sono stati ampiamente studiati e utilizzati in varie applicazioni biomediche74,75,76,77.Pertanto, è importante utilizzare il metodo di nanoindentazione AFM, che può misurare in modo accurato e affidabile le loro proprietà meccaniche.Ma allo stesso tempo, le proprietà uniche di questi materiali ultra morbidi, come il modulo elastico estremamente basso, l'elevato contenuto di liquidi e l'elevata elasticità, spesso rendono difficile la scelta del materiale, della forma e della forma giusti della sonda di indentazione.misurare.Questo è importante affinché il penetratore non perfori la superficie morbida del campione, il che comporterebbe errori nella determinazione del punto di contatto con la superficie e dell'area di contatto.
Per questo, è essenziale una comprensione completa della morfologia dei materiali biomimetici ultra-morbidi (lehfilcon A CL).Le informazioni sulla dimensione e la struttura delle spazzole polimeriche ramificate ottenute utilizzando il metodo di imaging forniscono la base per la caratterizzazione meccanica della superficie utilizzando tecniche di nanoindentazione AFM.Invece di sonde colloidali sferiche di dimensioni micron, abbiamo scelto la sonda al nitruro di silicio PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) con un diametro della punta di 140 nm, appositamente progettata per la mappatura quantitativa delle proprietà meccaniche di campioni biologici 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 La logica per l'utilizzo di sonde relativamente affilate rispetto alle sonde colloidali convenzionali può essere spiegata dalle caratteristiche strutturali del materiale.Confrontando la dimensione della punta della sonda (~ 140 nm) con le spazzole polimeriche ramificate sulla superficie di CL lehfilcon A, mostrate in Fig. 3a, si può concludere che la punta è abbastanza grande da entrare in contatto diretto con queste strutture a spazzola, che riduce la possibilità che la punta li perfori.Per illustrare questo punto, in Fig. 4 è presente un'immagine STEM del lehfilcon A CL e la punta rientrante della sonda AFM (disegnata in scala).
Schema che mostra l'immagine STEM di lehfilcon A CL e una sonda di indentazione ACM (disegnata in scala).
Inoltre, la dimensione della punta di 140 nm è sufficientemente piccola da evitare il rischio di uno qualsiasi degli effetti di estrusione appiccicosi precedentemente riportati per le spazzole polimeriche prodotte con il metodo di nanoindentazione CP-AFM69,71.Partiamo dal presupposto che, a causa della speciale forma cono-sferica e delle dimensioni relativamente piccole di questa punta AFM (Fig. 1), la natura della curva di forza generata dalla nanoindentazione di lehfilcon A CL non dipenderà dalla velocità di indentazione o dalla velocità di carico/scarico .Pertanto non risente degli effetti poroelastici.Per verificare questa ipotesi, i campioni di lehfilcon A CL sono stati rientrati a una forza massima fissa utilizzando una sonda PFQNM-LC-A-CAL, ma a due velocità diverse, e le curve di forza di trazione e retrazione risultanti sono state utilizzate per tracciare la forza (nN) nella separazione (μm) è mostrato nella Figura 5a.È chiaro che le curve di forza durante il carico e lo scarico si sovrappongono completamente, e non vi è alcuna prova chiara che la forza di taglio a profondità di indentazione pari a zero aumenti con la velocità di indentazione nella figura, suggerendo che i singoli elementi della spazzola sono stati caratterizzati senza un effetto poroelastico.Al contrario, gli effetti di ritenzione del fluido (estrusione viscosa ed effetti di poroelasticità) sono evidenti per la sonda AFM da 45 µm di diametro alla stessa velocità di rientranza e sono evidenziati dall'isteresi tra le curve di allungamento e ritrazione, come mostrato nella Figura 5b.Questi risultati supportano l'ipotesi e suggeriscono che le sonde da 140 nm di diametro sono una buona scelta per caratterizzare tali superfici morbide.
curve di forza di indentazione lehfilcon A CL utilizzando ACM;(a) utilizzando una sonda con un diametro di 140 nm a due velocità di carico, dimostrando l'assenza di un effetto poroelastico durante l'indentazione superficiale;(b) utilizzando sonde con un diametro di 45 µm e 140 nm.mostrano gli effetti dell'estrusione viscosa e della poroelasticità per sonde di grandi dimensioni rispetto a sonde più piccole.
Per caratterizzare le superfici ultramorbide, i metodi di nanoindentazione AFM devono disporre della sonda migliore per studiare le proprietà del materiale in studio.Oltre alla forma e alle dimensioni della punta, la sensibilità del sistema di rilevamento AFM, la sensibilità alla deflessione della punta nell'ambiente di test e la rigidità del cantilever svolgono un ruolo importante nel determinare l'accuratezza e l'affidabilità della nanoindentazione.misurazioni.Per il nostro sistema AFM, il limite di rilevamento del rilevatore sensibile alla posizione (PSD) è di circa 0,5 mV e si basa sulla velocità della molla precalibrata e sulla sensibilità di deflessione del fluido calcolata della sonda PFQNM-LC-A-CAL, che corrisponde al sensibilità al carico teorico.è inferiore a 0,1 pN.Pertanto, questo metodo consente la misurazione di una forza di indentazione minima ≤ 0,1 pN senza alcuna componente di rumore periferico.Tuttavia, è quasi impossibile per un sistema AFM ridurre il rumore periferico a questo livello a causa di fattori quali vibrazioni meccaniche e fluidodinamica.Questi fattori limitano la sensibilità complessiva del metodo di nanoindentazione AFM e determinano anche un segnale di rumore di fondo di circa ≤ 10 pN.Per la caratterizzazione della superficie, i campioni di substrato lehfilcon A CL e SiHy sono stati rientrati in condizioni completamente idratate utilizzando una sonda da 140 nm per la caratterizzazione SEM e le curve di forza risultanti sono state sovrapposte tra forza (pN) e pressione.Il grafico di separazione (μm) è mostrato nella Figura 6a.Rispetto al substrato di base SiHy, la curva di forza del lehfilcon A CL mostra chiaramente una fase di transizione che inizia nel punto di contatto con la spazzola polimerica biforcuta e termina con un brusco cambiamento nel contatto della punta con il materiale sottostante.Questa parte transitoria della curva di forza evidenzia il comportamento veramente elastico della spazzola polimerica ramificata sulla superficie, come evidenziato dalla curva di compressione che segue da vicino la curva di tensione e dal contrasto nelle proprietà meccaniche tra la struttura della spazzola e il materiale voluminoso SiHy.Confrontando lefilcon.Separazione della lunghezza media di una spazzola polimerica ramificata nell'immagine STEM del PCS (Fig. 3a) e la sua curva di forza lungo l'ascissa in Fig. 3a.6a mostra che il metodo è in grado di rilevare la punta e il polimero ramificato che raggiunge la sommità della superficie.Contatto tra strutture a spazzola.Inoltre, la stretta sovrapposizione delle curve di forza non indica alcun effetto di ritenzione di liquidi.In questo caso non c'è assolutamente alcuna adesione tra l'ago e la superficie del campione.Le sezioni più alte delle curve di forza per i due campioni si sovrappongono, riflettendo la somiglianza delle proprietà meccaniche dei materiali del substrato.
(a) Curve di forza di nanoindentazione AFM per substrati lehfilcon A CL e substrati SiHy, (b) curve di forza che mostrano la stima del punto di contatto utilizzando il metodo della soglia del rumore di fondo.
Al fine di studiare i dettagli più fini della curva di forza, la curva di tensione del campione lehfilcon A CL viene riprodotta in Fig. 6b con una forza massima di 50 pN lungo l'asse y.Questo grafico fornisce informazioni importanti sul rumore di fondo originale.Il rumore è nell'intervallo di ±10 pN, che viene utilizzato per determinare con precisione il punto di contatto e calcolare la profondità di rientranza.Come riportato in letteratura, l'identificazione dei punti di contatto è fondamentale per valutare accuratamente le proprietà del materiale come il modulo85.Un approccio che prevede l'elaborazione automatica dei dati della curva di forza ha mostrato una migliore corrispondenza tra l'adattamento dei dati e le misurazioni quantitative per i materiali morbidi86.In questo lavoro, la nostra scelta dei punti di contatto è relativamente semplice e obiettiva, ma ha i suoi limiti.Il nostro approccio conservativo alla determinazione del punto di contatto può comportare valori del modulo leggermente sovrastimati per profondità di indentazione inferiori (< 100 nm).L’uso del rilevamento dei punti di contatto basato su algoritmi e dell’elaborazione automatizzata dei dati potrebbe essere una continuazione di questo lavoro in futuro per migliorare ulteriormente il nostro metodo.Pertanto, per il rumore di fondo intrinseco dell'ordine di ±10 pN, definiamo il punto di contatto come il primo punto dati sull'asse x nella Figura 6b con un valore di ≥10 pN.Successivamente, secondo la soglia di rumore di 10 pN, una linea verticale a livello di ~0,27 µm segna il punto di contatto con la superficie, dopodiché la curva di stiramento continua fino a quando il substrato incontra la profondità di indentazione di ~270 nm.È interessante notare che, in base alle dimensioni delle caratteristiche ramificate della spazzola polimerica (300–400 nm) misurate utilizzando il metodo di imaging, la profondità di indentazione del campione CL lehfilcon A osservato utilizzando il metodo della soglia del rumore di fondo è di circa 270 nm, che è molto vicino a la dimensione della misurazione con STEM.Questi risultati confermano ulteriormente la compatibilità e l'applicabilità della forma e delle dimensioni della punta della sonda AFM per l'indentazione di questa struttura a spazzola polimerica ramificata molto morbida e altamente elastica.Questi dati forniscono anche una forte evidenza a sostegno del nostro metodo di utilizzo del rumore di fondo come soglia per individuare i punti di contatto.Pertanto, qualsiasi risultato quantitativo ottenuto dalla modellazione matematica e dall'adattamento della curva di forza dovrebbe essere relativamente accurato.
Le misurazioni quantitative mediante metodi di nanoindentazione AFM dipendono completamente dai modelli matematici utilizzati per la selezione dei dati e la successiva analisi.Pertanto, è importante considerare tutti i fattori legati alla scelta del penetratore, alle proprietà del materiale e alla meccanica della loro interazione prima di scegliere un modello particolare.In questo caso, la geometria della punta è stata attentamente caratterizzata utilizzando micrografie SEM (Fig. 1) e, in base ai risultati, la sonda per nanoindentazione AFM da 140 nm di diametro con un cono duro e una geometria della punta sferica è una buona scelta per caratterizzare i campioni di lehfilcon A CL79 .Un altro fattore importante da valutare attentamente è l'elasticità del materiale polimerico in prova.Sebbene i dati iniziali della nanoindentazione (Fig. 5a e 6a) delineino chiaramente le caratteristiche della sovrapposizione delle curve di tensione e compressione, cioè del completo recupero elastico del materiale, è estremamente importante confermare la natura puramente elastica dei contatti .A tal fine, sono state eseguite due rientranze successive nella stessa posizione sulla superficie del campione lehfilcon A CL a una velocità di rientranza di 1 µm/s in condizioni di completa idratazione.I dati della curva di forza risultante sono mostrati in fig.7 e, come previsto, le curve di espansione e compressione delle due stampe sono quasi identiche, evidenziando l'elevata elasticità della struttura ramificata del pennello polimerico.
Due curve di forza di indentazione nella stessa posizione sulla superficie di lehfilcon A CL indicano l'elasticità ideale della superficie della lente.
Sulla base delle informazioni ottenute dalle immagini SEM e STEM rispettivamente della punta della sonda e della superficie lehfilcon A CL, il modello cono-sfera è una rappresentazione matematica ragionevole dell'interazione tra la punta della sonda AFM e il materiale polimerico morbido da testare.Inoltre, per questo modello cono-sfera, le ipotesi fondamentali sulle proprietà elastiche del materiale stampato valgono per questo nuovo materiale biomimetico e vengono utilizzate per quantificare il modulo elastico.
Dopo una valutazione completa del metodo di nanoindentazione AFM e dei suoi componenti, comprese le proprietà della sonda di indentazione (forma, dimensione e rigidità della molla), sensibilità (rumore di fondo e stima del punto di contatto) e modelli di adattamento dei dati (misure quantitative del modulo), il metodo è stato usato.caratterizzare i campioni ultra-morbidi disponibili in commercio per verificare i risultati quantitativi.Un idrogel commerciale di poliacrilammide (PAAM) con un modulo elastico di 1 kPa è stato testato in condizioni idratate utilizzando una sonda da 140 nm.I dettagli sui test e sui calcoli dei moduli sono forniti nelle Informazioni supplementari.I risultati hanno mostrato che il modulo medio misurato era 0,92 kPa e la deviazione %RSD e percentuale (%) rispetto al modulo noto erano inferiori al 10%.Questi risultati confermano l'accuratezza e la riproducibilità del metodo di nanoindentazione AFM utilizzato in questo lavoro per misurare i moduli dei materiali ultramorbidi.Le superfici dei campioni lehfilcon A CL e del substrato di base SiHy sono state ulteriormente caratterizzate utilizzando lo stesso metodo di nanoindentazione AFM per studiare il modulo di contatto apparente della superficie ultrasoft in funzione della profondità di indentazione.Sono state generate curve di separazione della forza di rientranza per tre campioni di ciascun tipo (n = 3; una rientranza per campione) a una forza di 300 pN, una velocità di 1 µm/s e idratazione completa.La curva di condivisione della forza di indentazione è stata approssimata utilizzando un modello cono-sfera.Per ottenere un modulo dipendente dalla profondità di indentazione, è stata impostata una porzione larga 40 nm della curva di forza ad ogni incremento di 20 nm a partire dal punto di contatto e sono stati misurati i valori del modulo ad ogni passo della curva di forza.Spin Cy et al.Un approccio simile è stato utilizzato per caratterizzare il gradiente del modulo delle spazzole polimeriche di poli (lauril metacrilato) (P12MA) utilizzando la nanoindentazione della sonda AFM colloidale e sono coerenti con i dati utilizzando il modello di contatto Hertz.Questo approccio fornisce un grafico del modulo di contatto apparente (kPa) rispetto alla profondità di indentazione (nm), come mostrato nella Figura 8, che illustra il modulo di contatto apparente/gradiente di profondità.Il modulo elastico calcolato del campione CL lehfilcon A è compreso tra 2 e 3 kPa entro i 100 nm superiori del campione, oltre i quali inizia ad aumentare con la profondità.D'altra parte, quando si testa il substrato di base SiHy senza una pellicola a pennello sulla superficie, la profondità di indentazione massima raggiunta con una forza di 300 pN è inferiore a 50 nm e il valore del modulo ottenuto dai dati è di circa 400 kPa , che è paragonabile ai valori del modulo di Young per i materiali sfusi.
Modulo di contatto apparente (kPa) rispetto alla profondità di indentazione (nm) per i substrati lehfilcon A CL e SiHy utilizzando il metodo di nanoindentazione AFM con geometria cono-sfera per misurare il modulo.
La superficie superiore della nuova struttura a spazzola polimerica ramificata biomimetica presenta un modulo di elasticità estremamente basso (2–3 kPa).Ciò corrisponderà all'estremità libera della spazzola polimerica biforcuta come mostrato nell'immagine STEM.Sebbene vi siano prove di un gradiente di modulo sul bordo esterno del CL, il substrato principale ad alto modulo è più influente.Tuttavia, i primi 100 nm della superficie rientrano nel 20% della lunghezza totale della spazzola polimerica ramificata, quindi è ragionevole supporre che i valori misurati del modulo in questo intervallo di profondità di indentazione siano relativamente accurati e non fortemente influenzati dipendono dall'effetto dell'oggetto inferiore.
A causa dell'esclusivo design biomimetico delle lenti a contatto lehfilcon A, costituite da strutture ramificate di spazzole polimeriche PMPC innestate sulla superficie dei substrati SiHy, è molto difficile caratterizzare in modo affidabile le proprietà meccaniche delle loro strutture superficiali utilizzando metodi di misurazione tradizionali.Qui presentiamo un metodo avanzato di nanoindentazione AFM per caratterizzare accuratamente materiali ultra morbidi come il lefilcon A con un elevato contenuto di acqua ed elasticità estremamente elevata.Questo metodo si basa sull'uso di una sonda AFM la cui dimensione e geometria della punta sono scelte attentamente per corrispondere alle dimensioni strutturali delle caratteristiche superficiali ultra morbide da imprimere.Questa combinazione di dimensioni tra sonda e struttura fornisce una maggiore sensibilità, permettendoci di misurare il basso modulo e le proprietà elastiche intrinseche degli elementi a spazzola polimerici ramificati, indipendentemente dagli effetti poroelastici.I risultati hanno mostrato che gli esclusivi pennelli polimerici PMPC ramificati caratteristici della superficie della lente avevano un modulo elastico estremamente basso (fino a 2 kPa) e un'elasticità molto elevata (quasi il 100%) quando testati in un ambiente acquoso.I risultati della nanoindentazione AFM ci hanno permesso anche di caratterizzare il modulo di contatto apparente/gradiente di profondità (30 kPa/200 nm) della superficie della lente biomimetica.Questo gradiente può essere dovuto alla differenza di modulo tra le spazzole polimeriche ramificate e il substrato SiHy, o alla struttura/densità ramificata delle spazzole polimeriche, o ad una combinazione di questi.Tuttavia, sono necessari ulteriori studi approfonditi per comprendere appieno la relazione tra struttura e proprietà, in particolare l’effetto della ramificazione del pennello sulle proprietà meccaniche.Misurazioni simili possono aiutare a caratterizzare le proprietà meccaniche della superficie di altri materiali ultra morbidi e dispositivi medici.
I set di dati generati e/o analizzati durante lo studio in corso sono disponibili presso i rispettivi autori su ragionevole richiesta.
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