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医療機器や生物医学用途向けの新しい超軟質材料の開発に伴い、その物理的および機械的特性の包括的な特性評価は重要かつ困難です。改良型原子間力顕微鏡 (AFM) ナノインデンテーション技術を適用して、分岐ポリマー ブラシ構造の層でコーティングされた新しい lehfilcon A 生体模倣シリコーン ハイドロゲル コンタクト レンズの極めて低い表面弾性率を特徴付けました。この方法を使用すると、分岐ポリマーに近づくときに粘性押出の影響を受けることなく、接触点を正確に決定できます。さらに、多孔弾性の影響を受けることなく、個々のブラシ要素の機械的特性を決定することが可能になります。これは、柔らかい材料や生体サンプルの特性の測定に特に適した設計 (チップ サイズ、形状、バネ定数) を備えた AFM プローブを選択することによって実現されます。この方法は、表面積での弾性率が非常に低く (最大 2 kPa)、内部 (ほぼ 100%) 水環境では非常に高い弾性を有する、非常に柔らかい材料であるレーフィルコン A を正確に測定するための感度と精度を向上させます。 。表面研究の結果は、lehfilcon A レンズの非常に柔らかい表面特性を明らかにしただけでなく、分岐ポリマー ブラシの弾性率がシリコン水素基板の弾性率に匹敵することも示しました。この表面特性評価技術は、他の超軟質材料や医療機器にも適用できます。
生体組織と直接接触するように設計された材料の機械的特性は、多くの場合、生物学的環境によって決まります。これらの材料特性が完全に一致することにより、有害な細胞反応を引き起こすことなく、材料の望ましい臨床特性を達成することができます1、2、3。バルク均質材料の場合、標準的な手順と試験方法 (例: マイクロインデンテーション 4、5、6) が利用できるため、機械的特性の特性評価は比較的簡単です。ただし、ゲル、ヒドロゲル、生体高分子、生細胞などの超軟質材料の場合、測定分解能の制限や材料によっては不均一性があるため、これらの試験方法は一般に適用できません7。長年にわたり、従来の圧痕法は、幅広い軟質材料の特性を評価するために修正および適応されてきましたが、多くの方法には依然として、その使用を制限する重大な欠点があります8、9、10、11、12、13。超軟質材料および表面層の機械的特性を正確かつ確実に特徴付けることができる特殊な試験方法が存在しないため、さまざまな用途での使用が大幅に制限されています。
私たちの前回の研究では、目の角膜の表面にインスピレーションを得た潜在的な生体模倣デザインに由来する超軟質の表面特性をすべて備えた柔らかい異種材料である lehfilcon A (CL) コンタクト レンズを紹介しました。この生体材料は、医療機器用に設計されたシリコーン ハイドロゲル (SiHy) 15 にポリ(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン (MPC)) (PMPC) の分岐架橋ポリマー層をグラフトすることによって開発されました。このグラフト化プロセスにより、非常に柔らかく弾力性の高い分岐ポリマー ブラシ構造からなる層が表面に作成されます。私たちのこれまでの研究では、lehfilcon A CL の生体模倣構造が、濡れや汚れの防止の向上、潤滑性の向上、細胞や細菌の付着の軽減など、優れた表面特性を提供することが確認されています 15,16。さらに、この生体模倣材料の使用と開発は、他の生体医療機器へのさらなる拡張も示唆しています。したがって、将来の開発や応用をサポートする包括的な知識ベースを作成するには、この超軟質材料の表面特性を特徴付け、目との機械的相互作用を理解することが重要です。市販されているほとんどの SiHy コンタクト レンズは、均一な材料構造を形成する親水性ポリマーと疎水性ポリマーの均一な混合物で構成されています 17。従来の圧縮、引張、マイクロインデンテーション試験方法を使用して、その機械的特性を調査するためにいくつかの研究が行われてきました18、19、20、21。ただし、lehfilcon A CL の新しい生体模倣設計により、分岐ポリマー ブラシ構造の機械的特性が SiHy ベース基板の機械的特性と大幅に異なる、ユニークな異種材料となっています。したがって、従来のインデント法を使用してこれらの特性を正確に定量化することは非常に困難です。有望な方法は、原子間力顕微鏡 (AFM) で実装されたナノインデンテーション試験法を使用します。この方法は、生体細胞や組織、軟質ポリマーなどの軟質粘弾性材料の機械的特性を測定するために使用されています 22、23、24、25。 。 、26、27、28、29、30。 AFM ナノインデンテーションでは、ナノインデンテーション試験の基本と AFM 技術の最新の進歩が組み合わされて、測定感度が向上し、広範囲の本質的に超軟質材料の試験が可能になります 31,32,33,34,35,36。さらに、このテクノロジーは、さまざまな形状を使用することにより、他の重要な利点も提供します。圧子とプローブ、およびさまざまな液体媒体でのテストの可能性。
AFM ナノインデンテーションは、条件に応じて次の 3 つの主要なコンポーネントに分けることができます。(1) 機器 (センサー、検出器、プローブなど)。 (2) 測定パラメータ（力、変位、速度、ランプサイズなど）。 (3) データ処理（ベースライン補正、タッチポイント推定、データフィッティング、モデリングなど）。この方法の重大な問題は、AFM ナノインデンテーションを使用した文献のいくつかの研究が、同じ種類のサンプル/細胞/材料に対して非常に異なる定量的結果を報告していることです 37、38、39、40、41。たとえば、Lekka et al。機械的に均質なヒドロゲルと不均質な細胞のサンプルの測定されたヤング率に対する AFM プローブの形状の影響を研究し、比較しました。彼らは、弾性率の値はカンチレバーの選択と先端の形状に大きく依存し、ピラミッド型のプローブでは最高値、球状プローブでは最低値は 42 であると報告しています。同様に、Selhuber-Unkel et al.圧子の速度、圧子のサイズ、およびポリアクリルアミド (PAAM) サンプルの厚さが、ACM43 ナノインデンテーションによって測定されるヤング率にどのように影響するかが示されています。もう 1 つの複雑な要因は、標準的な超低弾性率試験材料と無料の試験手順が不足していることです。このため、自信を持って正確な結果を得ることが非常に困難になります。しかし、この方法は、例えば、AFM ナノインデンテーションを使用して正常細胞と癌細胞を区別するなど、類似した種類のサンプル間の相対測定および比較評価に非常に役立ちます 44、45。
AFM ナノインデンテーションで柔らかい材料をテストする場合、一般的な経験則として、最初のプローブがサンプルの表面を突き刺さないよう、サンプルの弾性率に厳密に一致する低いバネ定数 (k) と半球/丸い先端を持つプローブを使用します。柔らかい素材との最初の接触。プローブによって生成される偏向信号が、レーザー検出器システムによって検出されるのに十分な強度であることも重要です24、34、46、47。超軟質で不均一な細胞、組織、ゲルの場合、もう 1 つの課題は、再現性と信頼性の高い測定を保証するために、プローブとサンプル表面の間の接着力を克服することです48、49、50。最近まで、AFM ナノインデンテーションに関する研究のほとんどは、一般にコロイドプローブ (CP) と呼ばれる比較的大きな球状プローブを使用した、生物学的細胞、組織、ゲル、ヒドロゲル、および生体分子の機械的挙動の研究に焦点を当てていました。 、47、51、52、53、54、55。これらのチップの半径は 1 ～ 50 µm で、一般にホウケイ酸ガラス、ポリメチルメタクリレート (PMMA)、ポリスチレン (PS)、二酸化ケイ素 (SiO2)、ダイヤモンドで作られています。カーボン（DLC）のようなもの。 CP-AFM ナノインデンテーションは多くの場合、軟質サンプルの特性評価の最初の選択肢ですが、これには独自の問題と制限があります。大きなミクロンサイズの球状チップを使用すると、サンプルとチップの総接触面積が増加し、空間分解能が大幅に低下します。局所的な要素の機械的特性が広い領域の平均と大きく異なる可能性がある、柔らかく不均質な試験片の場合、CP 圧痕は局所的なスケールでの特性の不均一性を隠すことができます 52。コロイドプローブは通常、ミクロンサイズのコロイド球をエポキシ接着剤を使用してチップレスカンチレバーに取り付けることによって作られます。製造プロセス自体には多くの問題があり、プローブの校正プロセスに不一致が生じる可能性があります。さらに、コロイド粒子のサイズと質量は、共振周波数、バネの剛性、たわみ感度などのカンチレバーの主要な校正パラメータに直接影響します56、57、58。したがって、温度校正などの従来の AFM プローブで一般的に使用されている方法では、CP の正確な校正が提供されない可能性があり、これらの補正を実行するには他の方法が必要になる場合があります 57、59、60、61。 典型的な CP 押し込み実験では、大きな偏向カンチレバーを使用して、柔らかいサンプルの特性を調べると、比較的大きなカンチレバーの非線形挙動を校正するときに別の問題が発生します。偏差62、63、64。最新のコロイドプローブの押し込み法では、通常、プローブの校正に使用されるカンチレバーの形状が考慮されますが、コロイド粒子の影響は無視されるため、方法の精度にさらなる不確実性が生じます 38,61。同様に、接触モデルのフィッティングによって計算された弾性率は、押し込みプローブの形状に直接依存しており、チップとサンプル表面の特性間の不一致は不正確さを引き起こす可能性があります 27、65、66、67、68。Spencer らによる最近の研究では、 CP-AFM ナノインデンテーション法を使用してソフトポリマーブラシの特性を評価する際に考慮すべき要素が強調表示されます。彼らは、速度の関数としてポリマーブラシ内に粘性流体が保持されると、ヘッド負荷が増加し、したがって速度依存特性の測定値が異なることを報告しました30、69、70、71。
この研究では、改良された AFM ナノインデンテーション法を使用して、超軟質高弾性材料 lehfilcon A CL の表面弾性率を特性評価しました。この材料の特性と新しい構造を考慮すると、従来のインデンテーション法の感度範囲では、この非常に柔らかい材料の弾性率を特徴付けるには明らかに不十分であるため、高感度および低感度の AFM ナノインデンテーション法を使用する必要があります。レベル。既存のコロイドAFMプローブのナノインデンテーション技術の欠点と問題を検討した後、感度、バックグラウンドノイズ、ピンポイントの接触点を排除し、流体保持などの柔らかい異種材料の速度弾性率を測定するために、小型のカスタム設計のAFMプローブを選択した理由を示します。依存。そして正確な定量化。さらに、くぼみ先端の形状と寸法を正確に測定することができ、先端と材料の接触面積を評価することなく、円錐球フィットモデルを使用して弾性率を決定することができました。この研究で定量化される 2 つの暗黙の仮定は、完全に弾性のある材料特性と押し込み深さに依存しない弾性率です。この方法を使用して、最初に既知の弾性率を持つ超軟質標準をテストして方法を定量化し、次にこの方法を使用して 2 つの異なるコンタクト レンズ素材の表面の特性を評価しました。感度を高めてAFMナノインデンテーション表面を特徴付けるこの方法は、医療機器や生物医学用途での潜在的な用途を備えた広範囲の生体模倣異種超軟質材料に適用できると期待されています。
Lehfilcon A コンタクト レンズ (Alcon、米国テキサス州フォートワース) およびそのシリコーン ヒドロゲル基板がナノインデンテーション実験用に選択されました。実験では特別に設計されたレンズマウントが使用されました。テスト用のレンズをドーム型スタンドに気泡が入らないように慎重に置き、エッジで固定しました。レンズホルダー上部の固定具にある穴により、液体を所定の位置に保持しながらナノインデンテーション実験を行うためにレンズの光学中心にアクセスできます。これにより、レンズが完全に水分を保った状態に保たれます。 ５００μｌのコンタクトレンズ包装溶液を試験溶液として使用した。定量的結果を検証するために、市販の非活性化ポリアクリルアミド (PAAM) ヒドロゲルを、既知の弾性率 1 のポリアクリルアミド-co-メチレン-ビスアクリルアミド組成物 (100 mm Petrisoft ペトリ皿、Matrigen、アーバイン、カリフォルニア州、米国) から調製しました。 kPa。リン酸緩衝生理食塩水 (米国マサチューセッツ州テュークスベリーの Corning Life Sciences の PBS) を 4 ～ 5 滴 (約 125 μl) と、OPTI-FREE Puremoist コンタクト レンズ溶液 (米国テキサス州ヴォー州の Alcon) を 1 滴使用します。 ）AFMヒドロゲルとプローブの界面で。
Lehfilcon A CL および SiHy 基板のサンプルは、走査型透過電子顕微鏡 (STEM) 検出器を備えた FEI Quanta 250 電界放射型走査型電子顕微鏡 (FEG SEM) システムを使用して可視化されました。サンプルを準備するために、まずレンズを水で洗浄し、パイ型のくさびに切りました。サンプルの親水性成分と疎水性成分の間で異なるコントラストを実現するために、RuO4 の 0.10% 安定化溶液を色素として使用し、その中にサンプルを 30 分間浸漬しました。 lehfilcon A CL RuO4 染色は、微分コントラストの向上を達成するために重要であるだけでなく、分岐ポリマー ブラシの構造を元の形で保存するのにも役立ち、STEM 画像で確認できます。次いでそれらを洗浄し、エタノール濃度を増加させながら一連のエタノール/水混合物中で脱水した。次に、サンプルをEMBed 812/Aralditeエポキシでキャストし、70℃で一晩硬化させました。樹脂重合によって得られたサンプルブロックをウルトラミクロトームで切断し、得られた薄切片を加速電圧30 kVの低真空モードでSTEM検出器で可視化しました。同じ SEM システムを、PFQNM-LC-A-CAL AFM プローブ (Bruker Nano、サンタバーバラ、カリフォルニア州、米国) の詳細な特性評価に使用しました。 AFM プローブの SEM 画像は、加速電圧 30 kV の典型的な高真空モードで取得されました。さまざまな角度と倍率で画像を取得し、AFM プローブ先端の形状とサイズの詳細をすべて記録します。画像内の対象となる先端寸法はすべてデジタルで測定されました。
「PeakForce QNM in Fluid」モードを備えた Dimension FastScan Bio Icon 原子間力顕微鏡 (Bruker Nano、米国カリフォルニア州サンタバーバラ) を使用して、lehfilcon A CL、SiHy 基板、および PAAm ヒドロゲルサンプルを視覚化し、ナノインデントしました。イメージング実験では、公称先端半径 1 nm の PEAKFORCE-HIRS-FA プローブ (Bruker) を使用して、0.50 Hz のスキャン速度でサンプルの高解像度画像をキャプチャしました。すべての画像は水溶液中で撮影されました。
AFM ナノインデンテーション実験は、PFQNM-LC-A-CAL プローブ (Bruker) を使用して実行されました。 AFM プローブは、厚さ 345 nm、長さ 54 μm、幅 4.5 μm の窒化物カンチレバー上にシリコン チップを備え、共振周波数は 45 kHz です。これは、柔らかい生体サンプルの特性を評価し、定量的なナノメカニカル測定を実行するために特別に設計されています。センサーは工場で事前に調整されたスプリング設定を使用して個別に調整されます。この研究で使用されたプローブのバネ定数は 0.05 ～ 0.1 N/m の範囲でした。先端の形状とサイズを正確に決定するために、SEM を使用してプローブの特性を詳細に評価しました。図上。図 1a は、PFQNM-LC-A-CAL プローブの高解像度、低倍率の走査型電子顕微鏡写真を示しており、プローブ設計の全体像を示しています。図上。図１ｂは、プローブ先端の上部の拡大図を示し、先端の形状およびサイズに関する情報を提供する。先端では、針は直径約 140 nm の半球になります (図 1c)。これより下では、先端は円錐形に先細りになり、測定長さは約 500 nm に達します。先細領域の外側では、先端は円筒形であり、先端の全長は 1.18 µm で終わります。これはプローブチップの主要な機能部分です。さらに、先端直径 45 μm、バネ定数 2 N/m の大型球状ポリスチレン (PS) プローブ (Novascan Technologies, Inc.、米国アイオワ州ブーン) もコロイドプローブとしてテストに使用されました。比較のために PFQNM-LC-A-CAL 140 nm プローブを使用。
ナノインデント中に AFM プローブとポリマーブラシ構造の間に液体が閉じ込められる可能性があり、実際に表面に接触する前に AFM プローブに上向きの力がかかることが報告されています 69。流体の滞留によるこの粘性押し出し効果は、見かけの接触点を変化させる可能性があり、それによって表面弾性率の測定に影響を与える可能性があります。液体保持に対するプローブの形状と押し込み速度の影響を研究するために、直径 140 nm のプローブを使用して 1 µm/s および 2 µm/s の一定の変位速度で lehfilcon A CL サンプルの押し込み力曲線をプロットしました。プローブ直径 45 µm、固定力設定 6 nN を 1 µm/s で達成。直径 140 nm のプローブを使用した実験は、上まぶたの生理学的範囲 (1 ～ 8 kPa) 内の接触圧力が生じるように選択された、押し込み速度 1 μm/s、設定力 300 pN で実行されました。圧力 1 kPa の PAA ヒドロゲルの既製の柔らかいサンプルを、直径 140 nm のプローブを使用して 1 μm/s の速度で 50 pN の押込み力についてテストしました。
PFQNM-LC-A-CAL プローブの先端の円錐部分の長さは約 500 nm であるため、押し込み深さが 500 nm 未満の場合、押し込み中のプローブの形状はその形状に忠実であると想定できます。円錐形。さらに、試験対象の材料の表面は可逆的な弾性応答を示すと想定されており、これも次のセクションで確認します。したがって、先端の形状とサイズに応じて、AFM ナノインデンテーション実験 (NanoScope) を処理するために、ベンダーのソフトウェアで利用可能な Briscoe、Sebastian、Adams によって開発された円錐球フィッティング モデルを選択しました。分離データ解析ソフトウェア、Bruker) 73. このモデルは、球形の頂点欠陥を持つ円錐の力と変位の関係 F(δ) を記述します。図上。図 2 は、剛体円錐と球形先端部の相互作用時の接触形状を示しています。ここで、R は球形先端部の半径、a は接触半径、b は球形先端部の端での接触半径、δ は球形先端部の接触半径です。接触半径。押し込み深さ、θ は円錐の半角です。このプローブの SEM 画像は、直径 140 nm の球状先端が接線方向に融合して円錐になっていることが明確に示しているため、ここで b は R によってのみ定義されます。つまり、 b = R cos θ です。ベンダー提供のソフトウェアは、a > b を仮定して力分離データからヤング率 (E) 値を計算するための円錐と球の関係を提供します。関係：
ここで、F は押し込み力、E はヤング率、ν はポアソン比です。接触半径 a は次を使用して推定できます。
分岐ポリマー ブラシの表面層を備えた Lefilcon コンタクト レンズの素材に押し込まれた、球形の先端を備えた剛性の円錐の接触形状の図式。
a ≤ b の場合、この関係は従来の球状圧子の式に帰着します。
我々は、インデントプローブと PMPC ポリマーブラシの分岐構造との相互作用により、接触半径 a が球面接触半径 b より大きくなると考えています。したがって、この研究で実行された弾性率のすべての定量的測定では、a > b の場合に得られた依存性を使用しました。
この研究で研究された超軟質生体模倣材料は、サンプル断面の走査型透過電子顕微鏡 (STEM) と表面の原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して包括的に画像化されました。この詳細な表面特性評価は、以前に発表された研究の拡張として実行され、PMPC修飾レーフィルコンA CL表面の動的に分岐したポリマーブラシ構造が天然の角膜組織と同様の機械的特性を示すことが判明しました 14 。このため、私たちはコンタクトレンズの表面を生体模倣材料と呼んでいます14。図上。図３ａ、ｂは、それぞれ、レーフィルコンＡ ＣＬ基板および未処理のＳｉＨｙ基板の表面上の分岐ＰＭＰＣポリマーブラシ構造の断面を示す。両方のサンプルの表面を高解像度AFM画像を使用してさらに分析し、STEM分析の結果をさらに確認しました（図3c、d）。これらの画像を総合すると、300 ～ 400 nm での PMPC 分岐ポリマー ブラシ構造のおおよその長さがわかります。これは、AFM ナノインデンテーション測定を解釈するために重要です。画像から導き出されたもう 1 つの重要な観察は、CL 生体模倣材料の全体的な表面構造が SiHy 基板材料の表面構造とは形態学的に異なるということです。表面形態のこの違いは、押し込む AFM プローブとの機械的相互作用中に、その後の測定された弾性率値で明らかになることがあります。
(a) lehfilcon A CL および (b) SiHy 基板の断面 STEM 画像。スケールバー、500 nm。 lehfilcon A CL 基板 (c) とベース SiHy 基板 (d) の表面の AFM 画像 (3 μm × 3 μm)。
生体からインスピレーションを得たポリマーとポリマーブラシ構造は本質的に柔らかく、さまざまな生物医学用途で広く研究され、使用されています74、75、76、77。したがって、機械的特性を正確かつ確実に測定できるAFMナノインデンテーション法を使用することが重要です。しかし同時に、極度に低い弾性率、高い液体含有量、高い弾性など、これらの超軟質材料の独特の特性により、インデントプローブの適切な材料、形状、形状を選択することが困難になることがよくあります。サイズ。これは、圧子がサンプルの柔らかい表面に突き刺さらないようにするために重要です。これにより、表面との接触点や接触面積の決定に誤差が生じます。
このためには、超軟質生体模倣材料 (lehfilcon A CL) の形態を包括的に理解することが不可欠です。イメージング法を使用して得られた分岐ポリマー ブラシのサイズと構造に関する情報は、AFM ナノインデンテーション技術を使用した表面の機械的特性評価の基礎となります。ミクロンサイズの球状コロイドプローブの代わりに、生体サンプルの機械的特性の定量的マッピング用に特別に設計された、先端直径 140 nm の PFQNM-LC-A-CAL 窒化ケイ素プローブ (Bruker) を選択しました 78、79、80。 、81、82、83、84 従来のコロイドプローブと比較して比較的鋭いプローブを使用する理論的根拠は、コロイドプローブの構造的特徴によって説明できます。 材料。図3aに示すように、プローブの先端サイズ（約140 nm）とCL lehfilcon A表面の分岐ポリマーブラシを比較すると、先端はこれらのブラシ構造と直接接触するのに十分な大きさであると結論付けることができます。先端が貫通する可能性を減らします。この点を説明するために、図 4 に、lehfilcon A CL と AFM プローブのくぼみ先端の STEM 画像を示します (一定の縮尺で描かれています)。
lehfilcon A CL と ACM インデンテーション プローブの STEM 画像を示す概略図 (一定の縮尺で描かれています)。
さらに、140 nm という先端サイズは、CP-AFM ナノインデンテーション法で製造されたポリマーブラシについて以前に報告されている粘着性の押し出し効果のリスクを回避するのに十分な大きさです 69,71。この AFM チップの特殊な円錐球形の形状と比較的小さいサイズ (図 1) により、lehfilcon A CL ナノインデンテーションによって生成されるフォース カーブの性質は、押し込み速度やロード/アンロード速度に依存しないと考えられます。 。したがって、多孔弾性効果の影響を受けません。この仮説を検証するために、PFQNM-LC-A-CAL プローブを使用して、lehfilcon A CL サンプルを一定の最大力で、ただし 2 つの異なる速度で押し込み、結果として得られた引張力と収縮力の曲線を使用して力 (nN) をプロットしました。間隔 (μm) を図 5a に示します。荷重と除荷の間の力曲線が完全に重なっていることは明らかであり、図では押し込み深さゼロでの力せん断力が押し込み速度とともに増加するという明確な証拠はなく、個々のブラシ要素が多孔弾性効果なしで特徴付けられたことを示唆しています。対照的に、流体保持効果（粘性押出および多孔弾性効果）は、同じ押し込み速度で直径 45 μm の AFM プローブで明らかであり、図 5b に示すように、伸張曲線と収縮曲線の間のヒステリシスによって強調されます。これらの結果は仮説を裏付けており、このような柔らかい表面の特性評価には直径 140 nm のプローブが良い選択であることを示唆しています。
lehfilcon ACM を使用した CL 押し込みフォース カーブ。 (a) 直径 140 nm のプローブを 2 つの荷重速度で使用し、表面の押し込み中に多孔弾性効果が存在しないことを示しています。 (b) 直径 45 μm および 140 nm のプローブを使用します。小さなプローブと比較した大きなプローブの粘性押出と多孔弾性の影響を示しています。
超軟表面の特性を評価するには、AFM ナノインデンテーション法には、研究対象の材料の特性を研究するための最適なプローブが必要です。チップの形状とサイズに加えて、AFM 検出器システムの感度、テスト環境でのチップのたわみに対する感度、およびカンチレバーの剛性が、ナノインデンテーションの精度と信頼性を決定する際に重要な役割を果たします。測定。当社の AFM システムの場合、位置検出器 (PSD) の検出限界は約 0.5 mV で、事前に校正されたバネ定数と、PFQNM-LC-A-CAL プローブの計算された流体たわみ感度に基づいています。理論上の負荷感度。は0.1pN未満です。したがって、この方法では、周囲のノイズ成分なしで最小押し込み力 ≤ 0.1 pN の測定が可能です。ただし、機械振動や流体力学などの要因により、AFM システムが周囲のノイズをこのレベルまで低減することはほぼ不可能です。これらの要因により、AFM ナノインデンテーション法の全体的な感度が制限され、バックグラウンド ノイズ信号も約 ≤ 10 pN になります。表面特性評価では、SEM 特性評価用の 140 nm プローブを使用して、完全に水和した条件下で lehfilcon A CL および SiHy 基板サンプルを押し込み、得られたフォース カーブを力 (pN) と圧力の間で重ね合わせました。分離プロット (μm) を図 6a に示します。 SiHy ベース基板と比較すると、lehfilcon A CL フォース カーブは、フォーク状ポリマー ブラシとの接触点から始まり、先端と下にある材料との接触を示す傾斜の急激な変化で終わる遷移段階を明確に示しています。力曲線のこの移行部分は、引張曲線にぴったりと続く圧縮曲線と、ブラシ構造と嵩高い SiHy 材料の間の機械的特性のコントラストによって証明されるように、表面上の分岐ポリマー ブラシの真の弾性挙動を強調しています。レフィルコンと比較すると。 PCS の STEM 画像（図 3a）における分岐ポリマー ブラシの平均長さの分離と、図 3a の横軸に沿ったフォース カーブ。図６ａは、この方法が先端と表面最上部に到達する分岐ポリマーを検出できることを示している。ブラシ構造間の接触。さらに、力曲線が密接に重なっていることは、液体保持効果がないことを示しています。この場合、針と試料表面との間には全く付着がありません。 2 つのサンプルの力曲線の最上部のセクションは重なっており、基板材料の機械的特性の類似性を反映しています。
(a) lehfilcon A CL 基板および SiHy 基板の AFM ナノインデンテーション フォース カーブ、(b) バックグラウンド ノイズ閾値法を使用した接触点推定を示すフォース カーブ。
力曲線の詳細を調べるために、lehfilcon A CL サンプルの張力曲線を、y 軸に沿って最大力 50 pN で再プロットしました。このグラフは、元のバックグラウンド ノイズに関する重要な情報を提供します。ノイズは±10 pNの範囲にあり、接触点を正確に決定し、押し込み深さを計算するために使用されます。文献で報告されているように、接触点の特定は、弾性率などの材料特性を正確に評価するために重要です85。フォース カーブ データの自動処理を伴うアプローチにより、軟質材料のデータ フィッティングと定量的測定間の適合性が向上することが示されました 86。この作業では、連絡先の選択は比較的シンプルかつ客観的ですが、限界もあります。接触点を決定するための保守的なアプローチでは、より小さい押し込み深さ (< 100 nm) の弾性率値がわずかに過大評価される可能性があります。アルゴリズムベースのタッチポイント検出と自動データ処理の使用は、私たちの方法をさらに改善するために、将来的にこの研究の継続となる可能性があります。したがって、±10 pN程度の固有バックグラウンドノイズの場合、接触点を、値が10 pN以上である図6bのx軸上の最初のデータ点として定義します。次に、10 pN のノイズしきい値に従って、約 0.27 μm のレベルの垂直線が表面との接触点を示し、その後、基板が約 270 nm の押し込み深さに達するまで伸縮曲線が続きます。興味深いことに、イメージング法を使用して測定された分岐ポリマー ブラシ フィーチャのサイズ (300 ～ 400 nm) に基づいて、バックグラウンド ノイズ閾値法を使用して観察された CL lehfilcon A サンプルの押し込み深さは約 270 nm であり、これはほぼ 270 nm です。 STEMによる測定サイズ。これらの結果は、この非常に柔らかく弾性の高い分岐ポリマー ブラシ構造の押し込みに対する AFM プローブ先端の形状とサイズの適合性と適用性をさらに裏付けています。このデータは、接触点を特定するためのしきい値として背景ノイズを使用するという私たちの方法を裏付ける強力な証拠も提供します。したがって、数学的モデリングとフォース カーブ フィッティングから得られる定量的な結果は、比較的正確であるはずです。
AFM ナノインデンテーション法による定量測定は、データの選択とその後の分析に使用される数学的モデルに完全に依存しています。したがって、特定のモデルを選択する前に、圧子の選択、材料特性、およびそれらの相互作用の仕組みに関連するすべての要素を考慮することが重要です。この場合、先端形状は SEM 顕微鏡写真を使用して慎重に特性評価され (図 1)、その結果に基づいて、ハードコーンと球状先端形状を備えた直径 140 nm の AFM ナノインデンティング プローブは、lehfilcon A CL79 サンプルの特性評価に適しています。 。慎重に評価する必要があるもう 1 つの重要な要素は、試験対象のポリマー材料の弾性です。ナノインデンテーションの初期データ (図 5a および 6a) は、引張曲線と圧縮曲線の重なりの特徴、つまり材料の完全な弾性回復を明確に概説していますが、接触の純粋な弾性の性質を確認することが非常に重要です。 。この目的を達成するために、完全水和条件下で 1 μm/s の押し込み速度で、lehfilcon A CL サンプルの表面の同じ位置に 2 つの連続した押し込みを実行しました。結果として得られるフォース カーブ データを図に示します。予想どおり、2 つのプリントの膨張曲線と圧縮曲線はほぼ同一であり、分岐ポリマー ブラシ構造の高い弾性が強調されています。
レーフィルコン A CL の表面の同じ位置にある 2 つの押し込み力曲線は、レンズ表面の理想的な弾性を示​​しています。
プローブチップとレーフィルコン A CL 表面の SEM 画像と STEM 画像からそれぞれ得られた情報に基づいて、円錐球モデルは、AFM プローブチップとテスト対象の軟質ポリマー材料の間の相互作用を合理的に数学的に表現したものです。さらに、この円錐球モデルでは、インプリントされた材料の弾性特性に関する基本的な仮定がこの新しい生体模倣材料にも当てはまり、弾性率の定量化に使用されます。
AFM ナノインデンテーション法と、インデンテーション プローブの特性 (形状、サイズ、バネ剛性)、感度 (バックグラウンド ノイズと接触点の推定)、データ フィッティング モデル (定量的弾性率測定) などのコンポーネントを包括的に評価した後、この方法は使用済み。市販の超軟質サンプルの特徴を調べて、定量的な結果を検証します。弾性率 1 kPa の市販のポリアクリルアミド (PAAM) ヒドロゲルを、140 nm プローブを使用して水和条件下でテストしました。モジュールのテストと計算の詳細は、補足情報に記載されています。結果は、測定された平均弾性率が 0.92 kPa であり、既知の弾性率からの %RSD およびパーセンテージ (%) 偏差が 10% 未満であることを示しました。これらの結果は、超軟質材料の弾性率を測定するためにこの研究で使用された AFM ナノインデンテーション法の精度と再現性を裏付けています。 lehfilcon A CL サンプルと SiHy ベース基板の表面は、同じ AFM ナノインデンテーション法を使用してさらに特性評価され、超軟表面の見かけの接触弾性率を押し込み深さの関数として研究しました。押し込み力分離曲線は、各タイプの 3 つの試験片 (n = 3、試験片ごとに 1 つの押し込み) について、力 300 pN、速度 1 µm/s、完全水和で作成されました。押し込み力共有曲線は、円錐球モデルを使用して近似されました。押し込み深さに依存する弾性率を取得するために、フォース カーブの幅 40 nm の部分を接触点から開始して 20 nm ごとに設定し、フォース カーブの各ステップでの弾性率の値を測定しました。 Spin Cy et al.同様のアプローチが、コロイド AFM プローブのナノインデンテーションを使用したポリ (ラウリル メタクリレート) (P12MA) ポリマー ブラシの弾性率勾配の特性評価に使用されており、ヘルツ接触モデルを使用したデータと一致しています。このアプローチにより、図 8 に示すように、見かけの接触弾性率 (kPa) 対押し込み深さ (nm) のプロットが得られ、見かけの接触弾性率/深さの勾配が示されます。 CL lehfilcon A サンプルの計算された弾性率は、サンプルの上部 100 nm 以内で 2 ～ 3 kPa の範囲にあり、それを超えると深さとともに増加し始めます。一方、表面にブラシ状膜のないSiHyベース基板を試験した場合、300pNの力で達成される最大押し込み深さは50nm未満であり、データから得られるモジュラス値は約400kPaである。 、これはバルク材料のヤング率の値に匹敵します。
弾性率を測定するために円錐球形状の AFM ナノインデンテーション法を使用した、lehfilcon A CL および SiHy 基板の見掛け接触弾性率 (kPa) 対押し込み深さ (nm)。
新しい生体模倣分岐ポリマー ブラシ構造の最上面は、非常に低い弾性率 (2 ～ 3 kPa) を示します。これは、STEM 画像に示されているように、フォーク状ポリマー ブラシの自由吊り下げ端と一致します。 CL の外縁に弾性率勾配の証拠がいくつかありますが、主要な高弾性基材の影響がより大きくなります。ただし、表面の上部 100 nm は分岐ポリマー ブラシの全長の 20% 以内にあるため、この押し込み深さの範囲での弾性率の測定値は比較的正確であり、それほど強くないと考えるのが合理的です。下のオブジェクトの効果に依存します。
lehfilcon A コンタクト レンズは、SiHy 基板の表面にグラフトされた分岐 PMPC ポリマー ブラシ構造からなる独自の生体模倣設計により、従来の測定方法を使用して表面構造の機械的特性を確実に特性評価することは非常に困難です。今回我々は、水分含有量が高く、非常に高い弾性をもつレフィルコン A などの超軟質材料を正確に特徴付けるための高度な AFM ナノインデンテーション法を紹介します。この方法は、インプリントされる超軟表面フィーチャの構造寸法に一致するように、先端のサイズと形状が慎重に選択された AFM プローブの使用に基づいています。このプローブと構造間の寸法の組み合わせにより感度が向上し、多孔弾性効果に関係なく、分岐ポリマー ブラシ要素の低弾性率と固有の弾性特性を測定できるようになります。その結果、レンズ表面に特有の分岐状 PMPC ポリマー ブラシの特性は、水性環境でテストした場合、非常に低い弾性率 (最大 2 kPa) と非常に高い弾性 (ほぼ 100%) を示すことがわかりました。 AFM ナノインデンテーションの結果により、生体模倣レンズ表面の見かけの接触弾性率/深さ勾配 (30 kPa/200 nm) を特徴付けることもできました。この勾配は、分岐ポリマーブラシとＳｉＨｙ基板との間の弾性率の差、ポリマーブラシの分岐構造／密度、またはそれらの組み合わせによるものである可能性がある。ただし、構造と特性の関係、特に機械的特性に対するブラシの分岐の影響を完全に理解するには、さらに詳細な研究が必要です。同様の測定は、他の超軟質材料や医療機器の表面の機械的特性を特徴付けるのに役立ちます。
現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて各著者から入手できます。
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