Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Toont een carrousel met drie dia's tegelijk. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifregelaars aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Met de ontwikkeling van nieuwe ultrasoft materialen voor medische hulpmiddelen en biomedische toepassingen is de uitgebreide karakterisering van hun fysische en mechanische eigenschappen zowel belangrijk als uitdagend. Een gemodificeerde nano-indentatietechniek met atoomkrachtmicroscopie (AFM) werd toegepast om de extreem lage oppervlaktemodulus van de nieuwe biomimetische siliconenhydrogel contactlens lehfilcon A te karakteriseren. Deze lens is gecoat met een laag vertakte polymeerborstelstructuren. Deze methode maakt een nauwkeurige bepaling van contactpunten mogelijk zonder de effecten van viskeuze extrusie bij het benaderen van vertakte polymeren. Bovendien maakt het mogelijk om de mechanische eigenschappen van individuele borstelelementen te bepalen zonder het effect van poroelasticiteit. Dit wordt bereikt door een AFM-sonde te selecteren met een ontwerp (tipgrootte, geometrie en veerconstante) dat bijzonder geschikt is voor het meten van de eigenschappen van zachte materialen en biologische monsters. Deze methode verbetert de gevoeligheid en nauwkeurigheid voor een precieze meting van het zeer zachte materiaal lehfilcon A, dat een extreem lage elasticiteitsmodulus aan het oppervlak heeft (tot 2 kPa) en een extreem hoge elasticiteit in de interne (vrijwel 100%) waterige omgeving. De resultaten van het oppervlakteonderzoek brachten niet alleen de ultralichte oppervlakte-eigenschappen van de lehfilcon A-lens aan het licht, maar toonden ook aan dat de elasticiteitsmodulus van de vertakte polymeerborstels vergelijkbaar was met die van het silicium-waterstofsubstraat. Deze oppervlaktekarakteriseringstechniek kan worden toegepast op andere ultralichte materialen en medische hulpmiddelen.
De mechanische eigenschappen van materialen die ontworpen zijn voor direct contact met levend weefsel worden vaak bepaald door de biologische omgeving. De perfecte afstemming van deze materiaaleigenschappen helpt om de gewenste klinische kenmerken van het materiaal te bereiken zonder nadelige cellulaire reacties te veroorzaken1,2,3. Voor homogene bulkmaterialen is de karakterisering van mechanische eigenschappen relatief eenvoudig dankzij de beschikbaarheid van standaardprocedures en testmethoden (bijvoorbeeld micro-indentatie4,5,6). Voor ultrasoft materialen zoals gels, hydrogels, biopolymeren, levende cellen, enz. zijn deze testmethoden echter over het algemeen niet toepasbaar vanwege beperkingen in de meetresolutie en de inhomogeniteit van sommige materialen7. In de loop der jaren zijn traditionele indentatiemethoden aangepast om een ​​breed scala aan zachte materialen te karakteriseren, maar veel methoden kampen nog steeds met ernstige tekortkomingen die hun gebruik beperken8,9,10,11,12,13. Het gebrek aan gespecialiseerde testmethoden die de mechanische eigenschappen van supersoft materialen en oppervlaktelagen nauwkeurig en betrouwbaar kunnen karakteriseren, beperkt hun gebruik in diverse toepassingen aanzienlijk.
In ons eerdere werk introduceerden we de lehfilcon A (CL) contactlens, een zacht heterogeen materiaal met alle ultra-zachte oppervlakte-eigenschappen die voortkomen uit potentieel biomimetische ontwerpen, geïnspireerd op het oppervlak van het hoornvlies van het oog. Dit biomateriaal werd ontwikkeld door een vertakte, verknoopte polymeerlaag van poly(2-methacryloyloxyethylfosforylcholine (MPC)) (PMPC) te enten op een siliconenhydrogel (SiHy) 15, ontworpen voor medische hulpmiddelen. Dit entingsproces creëert een laag op het oppervlak die bestaat uit een zeer zachte en zeer elastische vertakte polymere borstelstructuur. Ons eerdere werk heeft bevestigd dat de biomimetische structuur van lehfilcon A CL superieure oppervlakte-eigenschappen biedt, zoals verbeterde bevochtiging en preventie van vervuiling, verhoogde smering en verminderde cel- en bacteriële adhesie15,16. Bovendien suggereert het gebruik en de ontwikkeling van dit biomimetische materiaal verdere uitbreiding naar andere biomedische hulpmiddelen. Het is daarom cruciaal om de oppervlakte-eigenschappen van dit ultrasoft materiaal te karakteriseren en de mechanische interactie ervan met het oog te begrijpen, om zo een uitgebreide kennisbasis te creëren ter ondersteuning van toekomstige ontwikkelingen en toepassingen. De meeste commercieel verkrijgbare SiHy-contactlenzen bestaan ​​uit een homogeen mengsel van hydrofiele en hydrofobe polymeren die een uniforme materiaalstructuur vormen17. Er zijn diverse studies uitgevoerd naar hun mechanische eigenschappen met behulp van traditionele compressie-, trek- en micro-indentatietests18,19,20,21. Het nieuwe biomimetische ontwerp van lehfilcon A CL maakt het echter een uniek heterogeen materiaal, waarbij de mechanische eigenschappen van de vertakte polymeerborstelstructuren significant verschillen van die van het SiHy-substraat. Het is daarom zeer moeilijk om deze eigenschappen nauwkeurig te kwantificeren met behulp van conventionele en indentatiemethoden. Een veelbelovende methode maakt gebruik van de nano-indentatietestmethode, geïmplementeerd in atoomkrachtmicroscopie (AFM). Deze methode is gebruikt om de mechanische eigenschappen te bepalen van zachte, visco-elastische materialen zoals biologische cellen en weefsels, en van zachte polymeren22,23,24,25,26,27,28,29,30. Bij AFM-nano-indentatie worden de grondbeginselen van nano-indentatietesten gecombineerd met de nieuwste ontwikkelingen in AFM-technologie om een ​​verhoogde meetgevoeligheid te bieden en een breed scala aan inherent superzachte materialen te testen31,32,33,34,35,36. Daarnaast biedt de technologie andere belangrijke voordelen door het gebruik van verschillende geometrieën van de indenter en de probe, en de mogelijkheid om te testen in diverse vloeibare media.
AFM-nano-indentatie kan voorwaardelijk worden onderverdeeld in drie hoofdcomponenten: (1) apparatuur (sensoren, detectoren, probes, enz.); (2) meetparameters (zoals kracht, verplaatsing, snelheid, hellingshoek, enz.); (3) gegevensverwerking (basislijncorrectie, schatting van het aanraakpunt, data-aanpassing, modellering, enz.). Een belangrijk probleem met deze methode is dat verschillende studies in de literatuur die gebruikmaken van AFM-nano-indentatie zeer uiteenlopende kwantitatieve resultaten rapporteren voor hetzelfde monster/cel/materiaaltype37,38,39,40,41. Lekka et al. onderzochten bijvoorbeeld de invloed van de geometrie van de AFM-probe op de gemeten Young-modulus van monsters van mechanisch homogene hydrogel en heterogene cellen en vergeleken deze. Zij rapporteren dat de moduluswaarden sterk afhankelijk zijn van de keuze van de cantilever en de vorm van de tip, met de hoogste waarde voor een piramidevormige probe en de laagste waarde voor een bolvormige probe. Selhuber-Unkel et al. Er is aangetoond hoe de indentersnelheid, de indentergrootte en de dikte van polyacrylamide (PAAM)-monsters de Young-modulus beïnvloeden die wordt gemeten met ACM43-nano-indentatie. Een andere complicerende factor is het gebrek aan standaard testmaterialen met een extreem lage modulus en gratis testprocedures. Dit maakt het erg moeilijk om met zekerheid nauwkeurige resultaten te verkrijgen. De methode is echter zeer nuttig voor relatieve metingen en vergelijkende evaluaties tussen vergelijkbare monstertypen, bijvoorbeeld door AFM-nano-indentatie te gebruiken om normale cellen van kankercellen te onderscheiden 44, 45.
Bij het testen van zachte materialen met AFM-nano-indentatie geldt over het algemeen de vuistregel om een ​​probe te gebruiken met een lage veerconstante (k) die nauw aansluit bij de modulus van het monster en een halfronde/ronde punt, zodat de eerste probe de oppervlakken van het monster niet doorboort bij het eerste contact met zachte materialen. Het is ook belangrijk dat het door de probe gegenereerde afbuigingssignaal sterk genoeg is om te worden gedetecteerd door het laserdetectorsysteem24,34,46,47. In het geval van ultrazachte heterogene cellen, weefsels en gels is een andere uitdaging het overwinnen van de adhesiekracht tussen de probe en het monsteroppervlak om reproduceerbare en betrouwbare metingen te garanderen48,49,50. Tot voor kort richtte het meeste onderzoek naar AFM-nano-indentatie zich op de studie van het mechanische gedrag van biologische cellen, weefsels, gels, hydrogels en biomoleculen met behulp van relatief grote bolvormige probes, die gewoonlijk colloïdale probes (CP's) worden genoemd. 47, 51, 52, 53, 54, 55. Deze tips hebben een straal van 1 tot 50 µm en worden gewoonlijk gemaakt van borosilicaatglas, polymethylmethacrylaat (PMMA), polystyreen (PS), siliciumdioxide (SiO2) en diamantachtige koolstof (DLC). Hoewel CP-AFM-nano-indentatie vaak de eerste keuze is voor de karakterisering van zachte monsters, kent het zijn eigen problemen en beperkingen. Het gebruik van grote, micron-grote bolvormige tips vergroot het totale contactoppervlak van de tip met het monster en resulteert in een aanzienlijk verlies aan ruimtelijke resolutie. Voor zachte, inhomogene monsters, waarbij de mechanische eigenschappen van lokale elementen aanzienlijk kunnen verschillen van het gemiddelde over een groter gebied, kan CP-indentatie elke inhomogeniteit in eigenschappen op lokale schaal maskeren52. Colloïdale probes worden doorgaans gemaakt door micron-grote colloïdale bollen met epoxylijm aan tiploze cantilevers te bevestigen. Het fabricageproces zelf is bezaaid met problemen en kan leiden tot inconsistenties in het kalibratieproces van de probe. Bovendien beïnvloeden de grootte en massa van colloïdale deeltjes direct de belangrijkste kalibratieparameters van de cantilever, zoals resonantiefrequentie, veerconstante en doorbuigingsgevoeligheid56,57,58. Daarom bieden gangbare methoden voor conventionele AFM-probes, zoals temperatuurkalibratie, mogelijk geen nauwkeurige kalibratie voor CP, en kunnen andere methoden nodig zijn om deze correcties uit te voeren57, 59, 60, 61. Typische CP-indentatie-experimenten maken gebruik van cantilevers met grote afwijkingen om de eigenschappen van zachte monsters te bestuderen, wat een ander probleem oplevert bij het kalibreren van het niet-lineaire gedrag van de cantilever bij relatief grote afwijkingen62,63,64. Moderne methoden voor colloïdale probe-indentatie houden meestal rekening met de geometrie van de cantilever die wordt gebruikt voor de kalibratie van de probe, maar negeren de invloed van colloïdale deeltjes, wat extra onzekerheid creëert in de nauwkeurigheid van de methode38,61. Op dezelfde manier zijn de elastische moduli die berekend worden door middel van contactmodelaanpassing direct afhankelijk van de geometrie van de indentatiesonde, en kan een mismatch tussen de eigenschappen van de tip en het monsteroppervlak leiden tot onnauwkeurigheden27, 65, 66, 67, 68. In recent werk van Spencer et al. worden de factoren belicht waarmee rekening moet worden gehouden bij het karakteriseren van zachte polymeerborstels met behulp van de CP-AFM nano-indentatiemethode. Zij rapporteerden dat het vasthouden van een viskeuze vloeistof in polymeerborstels als functie van de snelheid resulteert in een toename van de kopbelasting en dus in verschillende metingen van snelheidsafhankelijke eigenschappen30,69,70,71.
In deze studie hebben we de oppervlaktemodulus van het ultrasoft, zeer elastische materiaal lehfilcon A CL gekarakteriseerd met behulp van een gemodificeerde AFM-nano-indentatiemethode. Gezien de eigenschappen en de nieuwe structuur van dit materiaal, is het gevoeligheidsbereik van de traditionele indentatiemethode duidelijk onvoldoende om de modulus van dit extreem zachte materiaal te karakteriseren. Daarom is het noodzakelijk om een ​​AFM-nano-indentatiemethode te gebruiken met een hogere gevoeligheid en een lagere gevoeligheid. Na een overzicht van de tekortkomingen en problemen van bestaande colloïdale AFM-sonde-nano-indentatietechnieken, laten we zien waarom we hebben gekozen voor een kleinere, speciaal ontworpen AFM-sonde om de gevoeligheid en achtergrondruis te elimineren, het contactpunt nauwkeurig te bepalen, de snelheidsmodulus van zachte heterogene materialen te meten, inclusief de afhankelijkheid van vloeistofretentie, en nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken. Bovendien konden we de vorm en afmetingen van de indentatietip nauwkeurig meten, waardoor we het kegel-bol-fitmodel konden gebruiken om de elasticiteitsmodulus te bepalen zonder het contactoppervlak van de tip met het materiaal te hoeven beoordelen. De twee impliciete aannames die in dit werk worden gekwantificeerd, zijn de volledig elastische materiaaleigenschappen en de indringdiepte-onafhankelijke modulus. Met behulp van deze methode hebben we eerst ultrasoft standaarden met een bekende modulus getest om de methode te kwantificeren, en vervolgens hebben we deze methode gebruikt om de oppervlakken van twee verschillende contactlensmaterialen te karakteriseren. Deze methode voor het karakteriseren van AFM-nano-indentatieoppervlakken met verhoogde gevoeligheid zal naar verwachting toepasbaar zijn op een breed scala aan biomimetische heterogene ultrasoft materialen met potentieel gebruik in medische hulpmiddelen en biomedische toepassingen.
Voor nano-indentatie-experimenten werden Lehfilcon A-contactlenzen (Alcon, Fort Worth, Texas, VS) en hun siliconenhydrogelsubstraten gekozen. Een speciaal ontworpen lenshouder werd gebruikt. Om de lens voor de test te plaatsen, werd deze voorzichtig op de koepelvormige houder geplaatst, waarbij ervoor werd gezorgd dat er geen luchtbellen in kwamen, en vervolgens met de randen vastgezet. Een opening in de houder aan de bovenkant van de lenshouder biedt toegang tot het optische centrum van de lens voor nano-indentatie-experimenten, terwijl de vloeistof op zijn plaats wordt gehouden. Dit zorgt ervoor dat de lenzen volledig gehydrateerd blijven. 500 μl contactlensvloeistof werd gebruikt als testoplossing. Om de kwantitatieve resultaten te verifiëren, werden commercieel verkrijgbare niet-geactiveerde polyacrylamide (PAAM)-hydrogels bereid uit een polyacrylamide-co-methyleen-bisacrylamide-samenstelling (100 mm Petrisoft-petrischalen, Matrigen, Irvine, CA, VS), met een bekende elasticiteitsmodulus van 1 kPa. Gebruik 4-5 druppels (ongeveer 125 µl) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS van Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, VS) en 1 druppel OPTI-FREE Puremoist contactlensvloeistof (Alcon, Vaud, TX, VS) op het grensvlak tussen de AFM-hydrogel en de probe.
Monsters van Lehfilcon A CL- en SiHy-substraten werden gevisualiseerd met behulp van een FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM)-systeem, uitgerust met een Scanning Transmission Electron Microscope (STEM)-detector. Om de monsters voor te bereiden, werden de lenzen eerst met water gewassen en in taartpuntvormige stukken gesneden. Om een ​​differentieel contrast te verkrijgen tussen de hydrofiele en hydrofobe componenten van de monsters, werd een gestabiliseerde 0,10% RuO4-oplossing als kleurstof gebruikt, waarin de monsters gedurende 30 minuten werden ondergedompeld. De kleuring van Lehfilcon A CL met RuO4 is niet alleen belangrijk voor een verbeterd differentieel contrast, maar helpt ook om de structuur van de vertakte polymeerborstels in hun oorspronkelijke vorm te behouden, die vervolgens zichtbaar zijn op STEM-beelden. De monsters werden vervolgens gewassen en gedehydrateerd in een reeks ethanol/watermengsels met een toenemende ethanolconcentratie. Daarna werden de monsters ingegoten met EMBed 812/Araldite-epoxyhars, die een nacht uithardde bij 70 °C. Monsterblokken verkregen door harspolymerisatie werden gesneden met een ultramicrotoom, en de resulterende dunne secties werden gevisualiseerd met een STEM-detector in een lage vacuümmodus bij een versnellingsspanning van 30 kV. Hetzelfde SEM-systeem werd gebruikt voor gedetailleerde karakterisering van de PFQNM-LC-A-CAL AFM-sonde (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, VS). SEM-afbeeldingen van de AFM-sonde werden verkregen in een typische hoge vacuümmodus met een versnellingsspanning van 30 kV. Er werden afbeeldingen gemaakt onder verschillende hoeken en met verschillende vergrotingen om alle details van de vorm en grootte van de AFM-sondepunt vast te leggen. Alle relevante afmetingen van de punt in de afbeeldingen werden digitaal gemeten.
Een Dimension FastScan Bio Icon atoomkrachtmicroscoop (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, VS) met de modus "PeakForce QNM in Fluid" werd gebruikt om lehfilcon A CL, SiHy-substraat en PAAm-hydrogelmonsters te visualiseren en nano-indenteren. Voor beeldvormingsexperimenten werd een PEAKFORCE-HIRS-FA-sonde (Bruker) met een nominale tipradius van 1 nm gebruikt om beelden met hoge resolutie van het monster vast te leggen met een scansnelheid van 0,50 Hz. Alle beelden werden in een waterige oplossing gemaakt.
AFM-nano-indentatie-experimenten werden uitgevoerd met behulp van een PFQNM-LC-A-CAL-sonde (Bruker). De AFM-sonde heeft een siliciumtip op een nitride-cantilever met een dikte van 345 nm, een lengte van 54 µm en een breedte van 4,5 µm, en een resonantiefrequentie van 45 kHz. Deze is specifiek ontworpen voor het karakteriseren en uitvoeren van kwantitatieve nanomechanische metingen aan zachte biologische monsters. De sensoren worden individueel in de fabriek gekalibreerd met vooraf ingestelde veerinstellingen. De veerconstanten van de in dit onderzoek gebruikte sondes lagen in het bereik van 0,05–0,1 N/m. Om de vorm en grootte van de tip nauwkeurig te bepalen, werd de sonde gedetailleerd gekarakteriseerd met behulp van SEM. Figuur 1a toont een scanningelektronenmicroscoopafbeelding met hoge resolutie en lage vergroting van de PFQNM-LC-A-CAL-sonde, die een holistisch beeld geeft van het sondeontwerp. Figuur 1b toont een vergroot beeld van de bovenkant van de sondetip, die informatie geeft over de vorm en grootte van de tip. Aan het uiterste uiteinde is de naald een halve bol met een diameter van ongeveer 140 nm (Fig. 1c). Daaronder loopt de punt taps toe tot een kegelvorm en bereikt een gemeten lengte van ongeveer 500 nm. Buiten dit taps toelopende gedeelte is de punt cilindrisch en eindigt in een totale puntlengte van 1,18 µm. Dit is het belangrijkste functionele deel van de probe. Daarnaast werd ook een grote bolvormige polystyreen (PS) probe (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, VS) met een puntdiameter van 45 µm en een veerconstante van 2 N/m gebruikt voor testen als colloïdale probe, met de PFQNM-LC-A-CAL 140 nm probe ter vergelijking.
Er is gerapporteerd dat vloeistof kan worden ingesloten tussen de AFM-sonde en de polymeerborstelstructuur tijdens nano-indentatie, waardoor een opwaartse kracht op de AFM-sonde wordt uitgeoefend voordat deze het oppervlak daadwerkelijk raakt69. Dit viskeuze extrusie-effect als gevolg van vloeistofretentie kan het schijnbare contactpunt veranderen, waardoor metingen van de oppervlaktemodulus worden beïnvloed. Om het effect van de sondegeometrie en de indentatiesnelheid op vloeistofretentie te bestuderen, werden indentatiekrachtcurven uitgezet voor lehfilcon A CL-monsters met behulp van een sonde met een diameter van 140 nm bij constante verplaatsingssnelheden van 1 µm/s en 2 µm/s. Een sonde met een diameter van 45 µm en een vaste kracht van 6 nN werd bereikt bij 1 µm/s. Experimenten met een sonde met een diameter van 140 nm werden uitgevoerd bij een indentatiesnelheid van 1 µm/s en een ingestelde kracht van 300 pN, gekozen om een ​​contactdruk te creëren binnen het fysiologische bereik (1–8 kPa) van het bovenste ooglid. Bij een druk van 72 werden zachte, kant-en-klare monsters van PAA-hydrogel met een druk van 1 kPa getest op een indrukkracht van 50 pN bij een snelheid van 1 μm/s met behulp van een sonde met een diameter van 140 nm.
Aangezien de lengte van het conische deel van de punt van de PFQNM-LC-A-CAL-sonde ongeveer 500 nm bedraagt, kan voor elke indringdiepte < 500 nm met zekerheid worden aangenomen dat de geometrie van de sonde tijdens de indringing zijn kegelvorm behoudt. Daarnaast wordt aangenomen dat het oppervlak van het te testen materiaal een omkeerbare elastische respons vertoont, wat in de volgende paragrafen ook zal worden bevestigd. Afhankelijk van de vorm en grootte van de punt hebben we daarom gekozen voor het kegel-bol-aanpassingsmodel ontwikkeld door Briscoe, Sebastian en Adams, dat beschikbaar is in de software van de leverancier, om onze AFM-nano-indentatie-experimenten (NanoScope) te verwerken. (Software voor data-analyse van scheidingsgegevens, Bruker) 73. Het model beschrijft de kracht-verplaatsingsrelatie F(δ) voor een kegel met een bolvormig defect aan de top. Op fig. Figuur 2 toont de contactgeometrie tijdens de interactie van een stijve kegel met een bolvormige punt, waarbij R de straal van de bolvormige punt is, a de contactstraal, b de contactstraal aan het uiteinde van de bolvormige punt, δ de indringdiepte van de contactstraal en θ de halve openingshoek van de kegel. De SEM-afbeelding van deze sonde laat duidelijk zien dat de bolvormige punt met een diameter van 140 nm tangentieel overgaat in een kegel, dus hier wordt b alleen gedefinieerd door R, d.w.z. b = R cos θ. De door de fabrikant geleverde software biedt een kegel-bolrelatie om Youngs modulus (E) waarden te berekenen uit krachtscheidingsgegevens, ervan uitgaande dat a > b. Relatie:
waarbij F de indrukkracht is, E de elasticiteitsmodulus van Young en ν de Poisson-verhouding. De contactstraal a kan worden geschat met behulp van:
Schematische weergave van de contactgeometrie van een stijve kegel met een bolvormige punt die in het materiaal van een Lefilcon-contactlens is gedrukt, voorzien van een oppervlaktelaag van vertakte polymeerborstels.
Als a ≤ b, reduceert de relatie tot de vergelijking voor een conventionele bolvormige indrukker;
Wij zijn van mening dat de interactie van de indruksonde met de vertakte structuur van de PMPC-polymeerborstel ervoor zorgt dat de contactstraal a groter is dan de bolvormige contactstraal b. Daarom hebben we voor alle kwantitatieve metingen van de elasticiteitsmodulus die in dit onderzoek zijn uitgevoerd, de afhankelijkheid gebruikt die is verkregen voor het geval a > b.
De ultrasoft biomimetische materialen die in dit onderzoek zijn bestudeerd, werden uitgebreid in beeld gebracht met behulp van scanning transmissie-elektronenmicroscopie (STEM) van de dwarsdoorsnede van het monster en atoomkrachtmicroscopie (AFM) van het oppervlak. Deze gedetailleerde oppervlaktekarakterisering werd uitgevoerd als een uitbreiding van ons eerder gepubliceerde werk, waarin we vaststelden dat de dynamisch vertakte polymere borstelstructuur van het PMPC-gemodificeerde lehfilcon A CL-oppervlak vergelijkbare mechanische eigenschappen vertoonde als natief hoornvliesweefsel 14. Om deze reden noemen we contactlensoppervlakken biomimetische materialen14. Figuur 3a en 3b tonen dwarsdoorsneden van vertakte PMPC-polymeerborstelstructuren op respectievelijk het oppervlak van een lehfilcon A CL-substraat en een onbehandeld SiHy-substraat. De oppervlakken van beide monsters werden verder geanalyseerd met behulp van AFM-beelden met hoge resolutie, die de resultaten van de STEM-analyse verder bevestigden (Figuur 3c en 3d). Samengevat geven deze beelden een geschatte lengte van de vertakte polymeerborstelstructuur van PMPC van 300-400 nm, wat cruciaal is voor de interpretatie van AFM-nano-indentatiemetingen. Een andere belangrijke observatie uit de beelden is dat de algehele oppervlaktestructuur van het CL-biomimetische materiaal morfologisch verschilt van die van het SiHy-substraatmateriaal. Dit verschil in oppervlaktemorfologie kan zichtbaar worden tijdens de mechanische interactie met de indenterende AFM-sonde en vervolgens in de gemeten moduluswaarden.
Dwarsdoorsnede STEM-afbeeldingen van (a) lehfilcon A CL en (b) SiHy-substraat. Schaalbalk, 500 nm. AFM-afbeeldingen van het oppervlak van het lehfilcon A CL-substraat (c) en het basis SiHy-substraat (d) (3 µm × 3 µm).
Bio-geïnspireerde polymeren en polymeerborstelstructuren zijn inherent zacht en worden veelvuldig bestudeerd en gebruikt in diverse biomedische toepassingen74,75,76,77. Daarom is het belangrijk om de AFM-nano-indentatiemethode te gebruiken, waarmee hun mechanische eigenschappen nauwkeurig en betrouwbaar kunnen worden gemeten. Tegelijkertijd maken de unieke eigenschappen van deze ultrazachte materialen, zoals een extreem lage elasticiteitsmodulus, een hoog vloeistofgehalte en een hoge elasticiteit, het echter vaak moeilijk om het juiste materiaal, de juiste vorm en de juiste afmetingen van de indenter te kiezen. Dit is belangrijk om te voorkomen dat de indenter het zachte oppervlak van het monster doorboort, wat zou leiden tot fouten bij het bepalen van het contactpunt met het oppervlak en het contactoppervlak.
Hiervoor is een grondig begrip van de morfologie van ultrasoft biomimetische materialen (lehfilcon A CL) essentieel. Informatie over de grootte en structuur van de vertakte polymeerborstels, verkregen met behulp van de beeldvormingsmethode, vormt de basis voor de mechanische karakterisering van het oppervlak met behulp van AFM-nano-indentatietechnieken. In plaats van micron-grote sferische colloïdale probes kozen we voor de PFQNM-LC-A-CAL siliciumnitride probe (Bruker) met een tipdiameter van 140 nm, speciaal ontworpen voor kwantitatieve kartering van de mechanische eigenschappen van biologische monsters 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. De reden voor het gebruik van relatief scherpe probes in vergelijking met conventionele colloïdale probes kan worden verklaard door de structurele kenmerken van het materiaal. Als we de grootte van de probe-tip (~140 nm) vergelijken met de vertakte polymeerborstels op het oppervlak van CL lehfilcon A, zoals weergegeven in Fig. 3a, kunnen we concluderen dat de tip groot genoeg is om direct in contact te komen met deze borstelstructuren, waardoor de kans kleiner is dat de tip erdoorheen prikt. Ter illustratie hiervan is in Fig. 4 een STEM-afbeelding te zien van de lehfilcon A CL en de indrukpunt van de AFM-probe (op schaal getekend).
Schematische weergave van een STEM-afbeelding van lehfilcon A CL en een ACM-indentatiesonde (op schaal getekend).
Bovendien is de tipgrootte van 140 nm klein genoeg om het risico op de eerder gerapporteerde kleverige extrusie-effecten voor polymeerborstels geproduceerd met de CP-AFM nano-indentatiemethode te vermijden69,71. We gaan ervan uit dat, vanwege de speciale kegel-bolvorm en de relatief kleine afmetingen van deze AFM-tip (Fig. 1), de aard van de krachtcurve die wordt gegenereerd door lehfilcon A CL nano-indentatie niet afhankelijk is van de indentatiesnelheid of de laad-/ontlaadsnelheid. Daarom wordt deze niet beïnvloed door poro-elastische effecten. Om deze hypothese te testen, werden lehfilcon A CL-monsters geïndenteerd met een vaste maximale kracht met behulp van een PFQNM-LC-A-CAL-sonde, maar met twee verschillende snelheden. De resulterende trek- en terugtrekkrachtcurven werden gebruikt om de kracht (nN) uit te zetten tegen de scheiding (µm), zoals weergegeven in Figuur 5a. Het is duidelijk dat de krachtcurven tijdens het laden en lossen volledig overlappen, en er is geen duidelijk bewijs dat de schuifkracht bij een indringdiepte van nul toeneemt met de indringsnelheid in de figuur. Dit suggereert dat de afzonderlijke borstelelementen zijn gekarakteriseerd zonder poro-elastisch effect. Daarentegen zijn vloeistofretentie-effecten (viskeuze extrusie en poro-elasticiteitseffecten) duidelijk zichtbaar voor de AFM-sonde met een diameter van 45 µm bij dezelfde indringsnelheid en worden deze benadrukt door de hysteresis tussen de rek- en terugtrekcurven, zoals weergegeven in figuur 5b. Deze resultaten ondersteunen de hypothese en suggereren dat sondes met een diameter van 140 nm een ​​goede keuze zijn voor het karakteriseren van dergelijke zachte oppervlakken.
Lehfilcon A CL-indentatiekrachtcurven met behulp van ACM; (a) met een sonde met een diameter van 140 nm bij twee belastingssnelheden, waaruit blijkt dat er geen poro-elastisch effect optreedt tijdens oppervlakte-indentatie; (b) met sondes met een diameter van 45 µm en 140 nm. De figuren tonen de effecten van viskeuze extrusie en poro-elasticiteit voor grote sondes in vergelijking met kleinere sondes.
Om ultrasoft oppervlakken te karakteriseren, vereisen AFM-nano-indentatiemethoden de beste probe om de eigenschappen van het te onderzoeken materiaal te bestuderen. Naast de vorm en grootte van de tip spelen de gevoeligheid van het AFM-detectorsysteem, de gevoeligheid voor tipverbuiging in de testomgeving en de stijfheid van de cantilever een belangrijke rol bij het bepalen van de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van nano-indentatiemetingen. Voor ons AFM-systeem is de detectielimiet van de positiegevoelige detector (PSD) ongeveer 0,5 mV. Deze detectielimiet is gebaseerd op de vooraf gekalibreerde veerconstante en de berekende vloeistofverbuigingsgevoeligheid van de PFQNM-LC-A-CAL-probe, wat overeenkomt met de theoretische belastingsgevoeligheid van minder dan 0,1 pN. Deze methode maakt het dus mogelijk om een ​​minimale indrukkracht van ≤ 0,1 pN te meten zonder perifere ruis. Het is echter vrijwel onmogelijk voor een AFM-systeem om perifere ruis tot dit niveau te reduceren vanwege factoren zoals mechanische trillingen en vloeistofdynamica. Deze factoren beperken de algehele gevoeligheid van de AFM-nano-indentatiemethode en resulteren tevens in een achtergrondruissignaal van ongeveer ≤ 10 pN. Voor oppervlaktekarakterisering werden lehfilcon A CL- en SiHy-substraatmonsters onder volledig gehydrateerde omstandigheden geïndenteerd met een 140 nm-sonde voor SEM-karakterisering, en de resulterende krachtcurven werden gesuperponeerd tussen kracht (pN) en druk. De scheidingsgrafiek (µm) is weergegeven in figuur 6a. In vergelijking met het SiHy-basissubstraat vertoont de krachtcurve van lehfilcon A CL duidelijk een overgangsfase die begint bij het contactpunt met de vertakte polymeerborstel en eindigt met een scherpe verandering in helling die het contact van de tip met het onderliggende materiaal markeert. Dit overgangsgedeelte van de krachtcurve benadrukt het werkelijk elastische gedrag van de vertakte polymeerborstel op het oppervlak, zoals blijkt uit de compressiecurve die de trekcurve nauw volgt en het contrast in mechanische eigenschappen tussen de borstelstructuur en het omvangrijke SiHy-materiaal. Bij vergelijking met lefilcon. De scheiding van de gemiddelde lengte van een vertakte polymeerborstel in de STEM-afbeelding van de PCS (Fig. 3a) en de bijbehorende krachtcurve langs de x-as in Fig. 3a. Figuur 6a laat zien dat de methode in staat is om de punt en het vertakte polymeer dat de bovenkant van het oppervlak bereikt te detecteren. Contact tussen borstelstructuren. Bovendien duidt de nauwe overlap van de krachtcurven op geen vloeistofretentie-effect. In dit geval is er absoluut geen hechting tussen de naald en het oppervlak van het monster. De bovenste gedeelten van de krachtcurven voor de twee monsters overlappen elkaar, wat de gelijkenis van de mechanische eigenschappen van de substraatmaterialen weerspiegelt.
(a) AFM-nano-indentatiekrachtcurven voor lehfilcon A CL-substraten en SiHy-substraten, (b) krachtcurven die de schatting van het contactpunt weergeven met behulp van de drempelmethode voor achtergrondruis.
Om de fijnere details van de krachtcurve te bestuderen, is de spanningscurve van het lehfilcon A CL-monster opnieuw uitgezet in figuur 6b met een maximale kracht van 50 pN langs de y-as. Deze grafiek geeft belangrijke informatie over de oorspronkelijke achtergrondruis. De ruis ligt in het bereik van ±10 pN, wat gebruikt wordt om het contactpunt nauwkeurig te bepalen en de indringdiepte te berekenen. Zoals in de literatuur is gerapporteerd, is de identificatie van contactpunten cruciaal voor een nauwkeurige beoordeling van materiaaleigenschappen zoals de modulus85. Een aanpak met automatische verwerking van krachtcurvegegevens heeft een verbeterde overeenkomst tussen data-aanpassing en kwantitatieve metingen voor zachte materialen laten zien86. In dit werk is onze keuze van contactpunten relatief eenvoudig en objectief, maar heeft deze zijn beperkingen. Onze conservatieve aanpak voor het bepalen van het contactpunt kan leiden tot licht overschatte moduluswaarden voor kleinere indringdiepten (< 100 nm). Het gebruik van algoritmegebaseerde contactpuntdetectie en geautomatiseerde gegevensverwerking zou een vervolg op dit werk kunnen zijn om onze methode in de toekomst verder te verbeteren. Voor een intrinsieke achtergrondruis van ongeveer ±10 pN definiëren we het contactpunt als het eerste datapunt op de x-as in figuur 6b met een waarde van ≥10 pN. Vervolgens markeert een verticale lijn op een hoogte van ~0,27 µm, in overeenstemming met de ruisdrempel van 10 pN, het contactpunt met het oppervlak. Daarna loopt de rekcurve door totdat het substraat een indringdiepte van ~270 nm bereikt. Op basis van de grootte van de vertakte polymeerborstelstructuren (300-400 nm) gemeten met de beeldvormingsmethode, is de indringdiepte van het CL lehfilcon A-monster, waargenomen met de achtergrondruisdrempelmethode, ongeveer 270 nm. Dit komt zeer dicht in de buurt van de met STEM gemeten grootte. Deze resultaten bevestigen de geschiktheid en toepasbaarheid van de vorm en grootte van de AFM-sonde voor het indrukken van deze zeer zachte en zeer elastische vertakte polymeerborstelstructuur. Deze gegevens leveren ook sterk bewijs ter ondersteuning van onze methode om achtergrondruis als drempelwaarde te gebruiken voor het nauwkeurig lokaliseren van contactpunten. Daardoor zouden alle kwantitatieve resultaten verkregen uit wiskundige modellering en krachtcurve-aanpassing relatief nauwkeurig moeten zijn.
Kwantitatieve metingen met AFM-nano-indentatiemethoden zijn volledig afhankelijk van de wiskundige modellen die worden gebruikt voor dataselectie en de daaropvolgende analyse. Daarom is het belangrijk om alle factoren met betrekking tot de keuze van de indenter, materiaaleigenschappen en de mechanica van hun interactie in overweging te nemen alvorens een specifiek model te kiezen. In dit geval werd de tipgeometrie zorgvuldig gekarakteriseerd met behulp van SEM-microfoto's (Fig. 1), en op basis van de resultaten is de AFM-nano-indentatiesonde met een diameter van 140 nm, een harde kegel en een bolvormige tipgeometrie een goede keuze voor de karakterisering van lehfilcon A CL79-monsters. Een andere belangrijke factor die zorgvuldig moet worden geëvalueerd, is de elasticiteit van het te testen polymeermateriaal. Hoewel de initiële nano-indentatiegegevens (Fig. 5a en 6a) duidelijk de kenmerken van de overlapping van de trek- en compressiecurven weergeven, dat wil zeggen het volledige elastische herstel van het materiaal, is het uiterst belangrijk om het puur elastische karakter van de contacten te bevestigen. Hiertoe werden twee opeenvolgende indrukkingen uitgevoerd op dezelfde locatie op het oppervlak van het lehfilcon A CL-monster met een indruksnelheid van 1 µm/s onder volledig gehydrateerde omstandigheden. De resulterende krachtcurvegegevens worden weergegeven in figuur 7 en, zoals verwacht, zijn de uitzettings- en compressiecurven van de twee afdrukken vrijwel identiek, wat de hoge elasticiteit van de vertakte polymeerborstelstructuur benadrukt.
Twee indrukkrachtcurven op dezelfde locatie op het oppervlak van de Lehfilcon A CL-lens duiden op de ideale elasticiteit van het lensoppervlak.
Op basis van informatie verkregen uit SEM- en STEM-afbeeldingen van respectievelijk de punt van de probe en het oppervlak van lehfilcon A CL, is het kegel-bolmodel een redelijke wiskundige weergave van de interactie tussen de punt van de AFM-probe en het te testen zachte polymeermateriaal. Bovendien gelden voor dit kegel-bolmodel de fundamentele aannames over de elastische eigenschappen van het geïmprinte materiaal ook voor dit nieuwe biomimetische materiaal en worden deze gebruikt om de elasticiteitsmodulus te kwantificeren.
Na een uitgebreide evaluatie van de AFM-nano-indentatiemethode en de bijbehorende componenten, waaronder de eigenschappen van de indentatiesonde (vorm, grootte en veerconstante), de gevoeligheid (achtergrondruis en schatting van het contactpunt) en de data-aanpassingsmodellen (kwantitatieve modulusmetingen), werd de methode gebruikt om commercieel verkrijgbare ultrasoft monsters te karakteriseren en de kwantitatieve resultaten te verifiëren. Een commerciële polyacrylamide (PAAM) hydrogel met een elasticiteitsmodulus van 1 kPa werd getest onder gehydrateerde omstandigheden met behulp van een sonde van 140 nm. Details over de modulusmetingen en -berekeningen zijn te vinden in de aanvullende informatie. De resultaten toonden aan dat de gemiddelde gemeten modulus 0,92 kPa bedroeg en dat de %RSD en de procentuele afwijking (%) van de bekende modulus minder dan 10% waren. Deze resultaten bevestigen de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de in dit onderzoek gebruikte AFM-nano-indentatiemethode voor het meten van de moduli van ultrasoft materialen. De oppervlakken van de lehfilcon A CL-monsters en het SiHy-basissubstraat werden verder gekarakteriseerd met behulp van dezelfde AFM-nano-indentatiemethode om de schijnbare contactmodulus van het ultrasoft oppervlak te bestuderen als functie van de indringdiepte. Indentatiekrachtverdelingscurven werden gegenereerd voor drie monsters van elk type (n = 3; één indentatie per monster) bij een kracht van 300 pN, een snelheid van 1 µm/s en volledige hydratatie. De indentatiekrachtverdelingscurve werd benaderd met behulp van een kegel-bolmodel. Om de modulus te verkrijgen die afhankelijk is van de indringdiepte, werd een gedeelte van de krachtcurve van 40 nm breed ingesteld bij elke stap van 20 nm vanaf het contactpunt, en werden de waarden van de modulus bij elke stap van de krachtcurve gemeten. Spin Cy et al. Een vergelijkbare benadering is gebruikt om de modulusgradiënt van poly(laurylmethacrylaat) (P12MA) polymeerborstels te karakteriseren met behulp van colloïdale AFM-sonde nano-indentatie, en de resultaten komen overeen met gegevens verkregen met het Hertz-contactmodel. Deze benadering levert een grafiek op van de schijnbare contactmodulus (kPa) versus de indringdiepte (nm), zoals weergegeven in Figuur 8, die de schijnbare contactmodulus/dieptegradiënt illustreert. De berekende elasticiteitsmodulus van het CL lehfilcon A-monster ligt in het bereik van 2-3 kPa binnen de bovenste 100 nm van het monster, waarna deze begint toe te nemen met de diepte. Aan de andere kant, bij het testen van het SiHy-substraat zonder een borstelachtige film op het oppervlak, is de maximale indringdiepte die wordt bereikt bij een kracht van 300 pN minder dan 50 nm, en de uit de gegevens verkregen moduluswaarde is ongeveer 400 kPa, wat vergelijkbaar is met de waarden van de Young-modulus voor bulkmaterialen.
Schijnbare contactmodulus (kPa) versus indringdiepte (nm) voor lehfilcon A CL- en SiHy-substraten met behulp van de AFM-nano-indentatiemethode met kegel-bolgeometrie voor het meten van de modulus.
Het bovenste oppervlak van de nieuwe biomimetische vertakte polymeerborstelstructuur vertoont een extreem lage elasticiteitsmodulus (2–3 kPa). Dit komt overeen met het vrijhangende uiteinde van de vertakte polymeerborstel, zoals weergegeven in de STEM-afbeelding. Hoewel er enig bewijs is van een modulusgradiënt aan de buitenrand van de CL, is het substraat met de hoogste modulus de belangrijkste factor. De bovenste 100 nm van het oppervlak beslaat echter minder dan 20% van de totale lengte van de vertakte polymeerborstel, dus het is redelijk om aan te nemen dat de gemeten moduluswaarden in dit indringdieptebereik relatief nauwkeurig zijn en niet sterk afhankelijk zijn van de invloed van het onderliggende object.
Door het unieke biomimetische ontwerp van lehfilcon A-contactlenzen, bestaande uit vertakte PMPC-polymeerborstelstructuren geënt op het oppervlak van SiHy-substraten, is het zeer moeilijk om de mechanische eigenschappen van hun oppervlaktestructuren betrouwbaar te karakteriseren met traditionele meetmethoden. Hier presenteren we een geavanceerde AFM-nano-indentatiemethode voor het nauwkeurig karakteriseren van ultrasoft materialen zoals lefilcon A met een hoog watergehalte en een extreem hoge elasticiteit. Deze methode is gebaseerd op het gebruik van een AFM-sonde waarvan de tipgrootte en -geometrie zorgvuldig zijn gekozen om te passen bij de structurele afmetingen van de ultrasoft oppervlaktekenmerken die moeten worden afgedrukt. Deze combinatie van afmetingen tussen sonde en structuur zorgt voor een verhoogde gevoeligheid, waardoor we de lage modulus en inherente elastische eigenschappen van vertakte polymeerborstelelementen kunnen meten, ongeacht poro-elastische effecten. De resultaten toonden aan dat de unieke vertakte PMPC-polymeerborstels die kenmerkend zijn voor het lensoppervlak een extreem lage elasticiteitsmodulus (tot 2 kPa) en een zeer hoge elasticiteit (bijna 100%) hadden bij testen in een waterige omgeving. De resultaten van AFM-nano-indentatie stelden ons ook in staat om de schijnbare contactmodulus/dieptegradiënt (30 kPa/200 nm) van het biomimetische lensoppervlak te karakteriseren. Deze gradiënt kan te wijten zijn aan het modulusverschil tussen de vertakte polymeerborstels en het SiHy-substraat, of aan de vertakte structuur/dichtheid van de polymeerborstels, of een combinatie hiervan. Verder diepgaand onderzoek is echter nodig om de relatie tussen structuur en eigenschappen volledig te begrijpen, met name het effect van de vertakking van de borstels op de mechanische eigenschappen. Vergelijkbare metingen kunnen helpen bij het karakteriseren van de mechanische eigenschappen van het oppervlak van andere ultrasoft materialen en medische hulpmiddelen.
De datasets die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de betreffende auteurs.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. en Haugen, HJ. Biologische reacties op fysische en chemische eigenschappen van oppervlakken van biomaterialen. Chemical Society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM en Liu, X. Verbetering van van de mens afgeleide biomaterialen voor weefseltechnologie. Programmering. Polymer. De wetenschap. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Ontwerp, klinische implementatie en immuunrespons van biomaterialen in de regeneratieve geneeskunde. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK en Farr GM Een verbeterde methode voor het bepalen van hardheid en elasticiteitsmodulus met behulp van indrukproeven met belasting- en verplaatsingsmetingen. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM. Historische oorsprong van de indrukhardheidstest. alma mater. de wetenschap. technologieën. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Indentatiehardheidsmetingen op macro-, micro- en nanoschaal: een kritische evaluatie. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD en Clapperich, SM. Fouten in oppervlaktedetectie leiden tot overschatting van de modulus bij nano-indentatie van zachte materialen. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR en Yahya M.Yu. Evaluatie van de nano-indentatiemethode voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van heterogene nanocomposieten met behulp van experimentele en computationele methoden. The Science House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, en Owart, TS Mechanische karakterisering van zachte visco-elastische gels door middel van indruk- en optimalisatiegebaseerde inverse eindige-elementenanalyse. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J en Chaneler D. Optimalisatie van de bepaling van visco-elasticiteit met behulp van compatibele meetsystemen. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. en Pellillo, E. Nano-indentatie van polymere oppervlakken. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. en Van Vliet KJ Karakterisering van visco-elastische mechanische eigenschappen van zeer elastische polymeren en biologische weefsels met behulp van schokindentatie. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluatie van de elasticiteitsmodulus en adhesiearbeid van zachte materialen met behulp van de uitgebreide Borodich-Galanov (BG) methode en diepe indentatie. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Nanoscopische morfologie en mechanische eigenschappen van biomimetische polymere oppervlakken van siliconenhydrogel contactlenzen. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).