Takk for at du besøker Nature.com.Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig.Bruk Forrige og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk skyveknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Med utviklingen av nye ultramyke materialer for medisinsk utstyr og biomedisinske applikasjoner, er den omfattende karakteriseringen av deres fysiske og mekaniske egenskaper både viktig og utfordrende.En modifisert atomkraftmikroskopi (AFM) nanoindentasjonsteknikk ble brukt for å karakterisere den ekstremt lave overflatemodulen til den nye lehfilcon A biomimetisk silikonhydrogel-kontaktlinse belagt med et lag av forgrenede polymerbørstestrukturer.Denne metoden tillater presis bestemmelse av kontaktpunkter uten effekten av viskøs ekstrudering når man nærmer seg forgrenede polymerer.I tillegg gjør det det mulig å bestemme de mekaniske egenskapene til individuelle børsteelementer uten påvirkning av porelastisitet.Dette oppnås ved å velge en AFM-sonde med et design (spissstørrelse, geometri og fjærhastighet) som er spesielt egnet for å måle egenskapene til myke materialer og biologiske prøver.Denne metoden forbedrer følsomheten og nøyaktigheten for nøyaktig måling av det svært myke materialet lehfilcon A, som har en ekstremt lav elastisitetsmodul på overflaten (opptil 2 kPa) og en ekstremt høy elastisitet i det interne (nesten 100 %) vandige miljøet .Resultatene av overflatestudien avslørte ikke bare de ultramyke overflateegenskapene til lehfilcon A-linsen, men viste også at modulen til de forgrenede polymerbørstene var sammenlignbar med den til silisium-hydrogen-substratet.Denne overflatekarakteriseringsteknikken kan brukes på andre ultramyke materialer og medisinsk utstyr.
De mekaniske egenskapene til materialer designet for direkte kontakt med levende vev bestemmes ofte av det biologiske miljøet.Den perfekte matchen av disse materialegenskapene bidrar til å oppnå de ønskede kliniske egenskapene til materialet uten å forårsake uønskede cellulære responser1,2,3.For homogene bulkmaterialer er karakteriseringen av mekaniske egenskaper relativt enkel på grunn av tilgjengeligheten av standardprosedyrer og testmetoder (f.eks. mikroinnrykk4,5,6).For ultramyke materialer som geler, hydrogeler, biopolymerer, levende celler, etc., er imidlertid disse testmetodene generelt ikke anvendelige på grunn av begrensninger i måleoppløsningen og inhomogeniteten til enkelte materialer7.Gjennom årene har tradisjonelle innrykksmetoder blitt modifisert og tilpasset for å karakterisere et bredt spekter av myke materialer, men mange metoder lider fortsatt av alvorlige mangler som begrenser bruken8,9,10,11,12,13.Mangelen på spesialiserte testmetoder som nøyaktig og pålitelig kan karakterisere de mekaniske egenskapene til supermyke materialer og overflatelag, begrenser deres bruk i ulike applikasjoner sterkt.
I vårt tidligere arbeid introduserte vi kontaktlinsen lehfilcon A (CL), et mykt heterogent materiale med alle de ultramyke overflateegenskapene som stammer fra potensielt biomimetiske design inspirert av overflaten av øyets hornhinne.Dette biomaterialet ble utviklet ved å pode et forgrenet, tverrbundet polymerlag av poly(2-metakryloyloksyetylfosforylkolin (MPC)) (PMPC) på en silikonhydrogel (SiHy) 15 designet for medisinsk utstyr basert på.Denne podeprosessen skaper et lag på overflaten som består av en veldig myk og svært elastisk forgrenet polymerbørstestruktur.Vårt tidligere arbeid har bekreftet at den biomimetiske strukturen til lehfilcon A CL gir overlegne overflateegenskaper som forbedret forebygging av fukting og begroing, økt smøreevne og redusert celle- og bakterievedheft15,16.I tillegg antyder bruken og utviklingen av dette biomimetiske materialet også ytterligere utvidelse til andre biomedisinske enheter.Derfor er det avgjørende å karakterisere overflateegenskapene til dette ultramyke materialet og forstå dets mekaniske interaksjon med øyet for å skape en omfattende kunnskapsbase for å støtte fremtidige utviklinger og applikasjoner.De fleste kommersielt tilgjengelige SiHy-kontaktlinser er sammensatt av en homogen blanding av hydrofile og hydrofobe polymerer som danner en jevn materialstruktur17.Flere studier har blitt utført for å undersøke deres mekaniske egenskaper ved bruk av tradisjonelle kompresjons-, strekk- og mikroinnrykk-testmetoder18,19,20,21.Imidlertid gjør den nye biomimetiske designen til lehfilcon A CL det til et unikt heterogent materiale der de mekaniske egenskapene til de forgrenede polymerbørstestrukturene skiller seg betydelig fra de til SiHy-basesubstratet.Derfor er det svært vanskelig å kvantifisere disse egenskapene nøyaktig ved bruk av konvensjonelle metoder og innrykksmetoder.En lovende metode bruker nanoindentasjonstestmetoden implementert i atomkraftmikroskopi (AFM), en metode som har blitt brukt til å bestemme de mekaniske egenskapene til myke viskoelastiske materialer som biologiske celler og vev, samt myke polymerer22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.I AFM nanoindentasjon kombineres det grunnleggende med nanoindentasjonstesting med de siste fremskrittene innen AFM-teknologi for å gi økt målefølsomhet og testing av et bredt spekter av iboende supermyke materialer31,32,33,34,35,36.I tillegg gir teknologien andre viktige fordeler gjennom bruk av ulike geometrier.indenter og sonde og mulighet for testing i ulike flytende medier.
AFM nanoindentasjon kan betinget deles inn i tre hovedkomponenter: (1) utstyr (sensorer, detektorer, sonder, etc.);(2) måleparametere (som kraft, forskyvning, hastighet, rampestørrelse, etc.);(3) Databehandling (grunnlinjekorreksjon, berøringspunktestimering, datatilpasning, modellering, etc.).Et betydelig problem med denne metoden er at flere studier i litteraturen som bruker AFM nanoindentasjon rapporterer svært forskjellige kvantitative resultater for samme prøve/celle/materialtype37,38,39,40,41.For eksempel har Lekka et al.Påvirkningen av AFM-probegeometri på den målte Youngs modul av prøver av mekanisk homogen hydrogel og heterogene celler ble studert og sammenlignet.De rapporterer at modulverdier er svært avhengige av utkragervalg og spissform, med den høyeste verdien for en pyramideformet sonde og den laveste verdien på 42 for en sfærisk sonde.Tilsvarende har Selhuber-Unkel et al.Det har blitt vist hvordan innrykkhastigheten, innrykkstørrelsen og tykkelsen til prøver av polyakrylamid (PAAM) påvirker Youngs modul målt ved ACM43 nanoindentasjon.En annen kompliserende faktor er mangelen på standard testmaterialer med ekstrem lav modul og gratis testprosedyrer.Dette gjør det svært vanskelig å få nøyaktige resultater med selvtillit.Metoden er imidlertid svært nyttig for relative målinger og komparative evalueringer mellom lignende prøvetyper, for eksempel ved å bruke AFM nanoindentasjon for å skille normale celler fra kreftceller 44, 45.
Ved testing av myke materialer med AFM nanoindentasjon er en generell tommelfingerregel å bruke en sonde med lav fjærkonstant (k) som stemmer godt overens med prøvemodulen og en halvkuleformet/rund spiss slik at den første sonden ikke trenger hull i prøveoverflatene på første kontakt med myke materialer.Det er også viktig at avbøyningssignalet som genereres av sonden er sterkt nok til å bli oppdaget av laserdetektorsystemet24,34,46,47.Når det gjelder ultramyke heterogene celler, vev og geler, er en annen utfordring å overvinne klebekraften mellom sonden og prøveoverflaten for å sikre reproduserbare og pålitelige målinger48,49,50.Inntil nylig har mesteparten av arbeidet med AFM nanoindentasjon fokusert på studiet av den mekaniske oppførselen til biologiske celler, vev, geler, hydrogeler og biomolekyler ved bruk av relativt store sfæriske prober, ofte referert til som kolloidale prober (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Disse spissene har en radius på 1 til 50 µm og er vanligvis laget av borosilikatglass, polymetylmetakrylat (PMMA), polystyren (PS), silisiumdioksid (SiO2) og diamant- som karbon (DLC).Selv om CP-AFM nanoindentasjon ofte er førstevalget for myk prøvekarakterisering, har den sine egne problemer og begrensninger.Bruken av store sfæriske spisser i mikron øker spissens totale kontaktareal med prøven og resulterer i et betydelig tap av romlig oppløsning.For myke, inhomogene prøver, der de mekaniske egenskapene til lokale elementer kan avvike betydelig fra gjennomsnittet over et større område, kan CP-innrykk skjule enhver inhomogenitet i egenskaper på lokal skala52.Kolloide prober lages vanligvis ved å feste kolloidale kuler i mikronstørrelse til tuppløse utkragere ved å bruke epoksylim.Selve produksjonsprosessen er full av mange problemer og kan føre til inkonsekvenser i probekalibreringsprosessen.I tillegg påvirker størrelsen og massen av kolloidale partikler direkte hovedkalibreringsparametrene til utkragingen, slik som resonansfrekvens, fjærstivhet og avbøyningsfølsomhet56,57,58.Derfor kan det hende at vanlige metoder for konvensjonelle AFM-sonder, som temperaturkalibrering, ikke gir en nøyaktig kalibrering for CP, og det kan være nødvendig med andre metoder for å utføre disse korreksjonene57, 59, 60, 61. Typiske CP-innrykksforsøk bruker store avvik utkrager for å studer egenskapene til myke prøver, noe som skaper et annet problem ved kalibrering av den ikke-lineære oppførselen til utkrageren ved relativt store avvik62,63,64.Moderne kolloidale sondeinnrykksmetoder tar vanligvis hensyn til geometrien til utkragingen som brukes til å kalibrere sonden, men ignorerer påvirkningen fra kolloidale partikler, noe som skaper ytterligere usikkerhet i nøyaktigheten til metoden38,61.Tilsvarende er elastiske moduler beregnet ved kontaktmodelltilpasning direkte avhengig av geometrien til innrykkssonden, og misforhold mellom spiss- og prøveoverflatekarakteristikker kan føre til unøyaktigheter27, 65, 66, 67, 68. Noen nyere arbeid av Spencer et al.Faktorene som bør tas i betraktning ved karakterisering av myke polymerbørster ved bruk av CP-AFM nanoindenteringsmetoden er fremhevet.De rapporterte at retensjon av en viskøs væske i polymerbørster som en funksjon av hastighet resulterer i en økning i hodebelastning og dermed forskjellige målinger av hastighetsavhengige egenskaper30,69,70,71.
I denne studien har vi karakterisert overflatemodulen til det ultramyke høyelastiske materialet lehfilcon A CL ved bruk av en modifisert AFM nanoindenteringsmetode.Gitt egenskapene og den nye strukturen til dette materialet, er følsomhetsområdet til den tradisjonelle innrykkmetoden tydeligvis utilstrekkelig til å karakterisere modulen til dette ekstremt myke materialet, så det er nødvendig å bruke en AFM nanoindentasjonsmetode med høyere følsomhet og lavere følsomhet.nivå.Etter å ha gjennomgått manglene og problemene med eksisterende kolloidale AFM-sonde nanoindentasjonsteknikker, viser vi hvorfor vi valgte en mindre, spesialdesignet AFM-sonde for å eliminere følsomhet, bakgrunnsstøy, nøyaktig kontaktpunkt, måle hastighetsmodulen til myke heterogene materialer som væskeretensjon avhengighet.og nøyaktig kvantifisering.I tillegg var vi i stand til å nøyaktig måle formen og dimensjonene til innrykkspissen, slik at vi kunne bruke kjeglekuletilpasningsmodellen for å bestemme elastisitetsmodulen uten å vurdere spissens kontaktområde med materialet.De to implisitte antakelsene som er kvantifisert i dette arbeidet er de fullt elastiske materialegenskapene og den innrykningsdybdeuavhengige modulen.Ved å bruke denne metoden testet vi først ultramyke standarder med en kjent modul for å kvantifisere metoden, og brukte deretter denne metoden for å karakterisere overflatene til to forskjellige kontaktlinsematerialer.Denne metoden for å karakterisere AFM nanoindentasjonsoverflater med økt følsomhet forventes å være anvendelig på et bredt spekter av biomimetiske heterogene ultramyke materialer med potensiell bruk i medisinsk utstyr og biomedisinske applikasjoner.
Lehfilcon A-kontaktlinser (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) og deres silikonhydrogelsubstrater ble valgt for eksperimenter med nanoinnentering.Et spesialdesignet linsefeste ble brukt i eksperimentet.For å installere linsen for testing ble den forsiktig plassert på det kuppelformede stativet, og passet på at ingen luftbobler kom inn, og deretter festet med kantene.Et hull i fiksturen på toppen av linseholderen gir tilgang til det optiske senteret av linsen for nanoindentasjonseksperimenter mens væsken holdes på plass.Dette holder linsene fullstendig hydrert.500 μl emballasjeløsning for kontaktlinser ble brukt som testløsning.For å verifisere de kvantitative resultatene ble kommersielt tilgjengelige ikke-aktivert polyakrylamid (PAAM) hydrogeler fremstilt fra en polyakrylamid-ko-metylen-bisakrylamid-sammensetning (100 mm Petrisoft petriskåler, Matrigen, Irvine, CA, USA), en kjent elastisitetsmodul på 1 kPa.Bruk 4-5 dråper (ca. 125 µl) fosfatbufret saltvann (PBS fra Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) og 1 dråpe OPTI-FREE Puremoist kontaktlinseløsning (Alcon, Vaud, TX, USA).) ved AFM-hydrogel-probe-grensesnittet.
Prøver av Lehfilcon A CL- og SiHy-substrater ble visualisert ved bruk av et FEI Quanta 250 feltemisjonsskanningelektronmikroskop (FEG SEM)-system utstyrt med en skanningstransmisjonselektronmikroskopdetektor (STEM).For å forberede prøvene ble linsene først vasket med vann og kuttet i paiformede kiler.For å oppnå en differensiell kontrast mellom de hydrofile og hydrofobe komponentene i prøvene, ble en 0,10 % stabilisert løsning av RuO4 brukt som fargestoff, hvori prøvene ble nedsenket i 30 minutter.Lehfilcon A CL RuO4-fargingen er viktig ikke bare for å oppnå forbedret differensialkontrast, men bidrar også til å bevare strukturen til de forgrenede polymerbørstene i sin opprinnelige form, som deretter er synlige på STEM-bilder.De ble deretter vasket og dehydrert i en serie etanol/vann-blandinger med økende etanolkonsentrasjon.Prøvene ble deretter støpt med EMBed 812/Araldite epoxy, som herdet over natten ved 70°C.Prøveblokker oppnådd ved harpikspolymerisering ble kuttet med en ultramikrotom, og de resulterende tynne seksjonene ble visualisert med en STEM-detektor i lavvakuummodus ved en akselererende spenning på 30 kV.Det samme SEM-systemet ble brukt for detaljert karakterisering av PFQNM-LC-A-CAL AFM-sonden (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA).SEM-bilder av AFM-sonden ble oppnådd i en typisk høyvakuummodus med en akselererende spenning på 30 kV.Skaff bilder i forskjellige vinkler og forstørrelser for å registrere alle detaljene om formen og størrelsen på AFM-probespissen.Alle spissdimensjoner av interesse i bildene ble målt digitalt.
Et Dimension FastScan Bio Icon atomkraftmikroskop (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) med "PeakForce QNM in Fluid"-modus ble brukt til å visualisere og nanoindentere lehfilcon A CL, SiHy substrat og PAAm hydrogelprøver.For avbildningseksperimenter ble en PEAKFORCE-HIRS-FA-sonde (Bruker) med en nominell spissradius på 1 nm brukt for å fange høyoppløselige bilder av prøven med en skannehastighet på 0,50 Hz.Alle bildene ble tatt i vandig løsning.
AFM nanoindentasjonseksperimenter ble utført ved bruk av en PFQNM-LC-A-CAL-sonde (Bruker).AFM-sonden har en silisiumspiss på en nitridutkrager 345 nm tykk, 54 µm lang og 4,5 µm bred med en resonansfrekvens på 45 kHz.Den er spesielt designet for å karakterisere og utføre kvantitative nanomekaniske målinger på myke biologiske prøver.Sensorene er individuelt kalibrert fra fabrikk med forhåndskalibrerte fjærinnstillinger.Fjærkonstantene til probene som ble brukt i denne studien var i området 0,05–0,1 N/m.For nøyaktig å bestemme formen og størrelsen på spissen, ble sonden karakterisert i detalj ved hjelp av SEM.På fig.Figur 1a viser et skanningselektronmikrofotografi med høy oppløsning og lav forstørrelse av PFQNM-LC-A-CAL-sonden, og gir en helhetlig oversikt over probedesignet.På fig.1b viser et forstørret riss av toppen av sondespissen, og gir informasjon om formen og størrelsen på spissen.I den ytterste enden er nålen en halvkule på ca. 140 nm i diameter (fig. 1c).Under dette smalner spissen til en konisk form og når en målt lengde på omtrent 500 nm.Utenfor det avsmalnende området er tuppen sylindrisk og ender i en total tupplengde på 1,18 µm.Dette er den viktigste funksjonelle delen av sondespissen.I tillegg ble en stor sfærisk polystyren (PS) sonde (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) med en spissdiameter på 45 µm og en fjærkonstant på 2 N/m også brukt for testing som en kolloidal sonde.med PFQNM-LC-A-CAL 140 nm sonde for sammenligning.
Det er rapportert at væske kan fanges mellom AFM-sonden og polymerbørstestrukturen under nanoinnentering, noe som vil utøve en oppadgående kraft på AFM-sonden før den faktisk berører overflaten69.Denne viskøse ekstruderingseffekten på grunn av væskeretensjon kan endre det tilsynelatende kontaktpunktet, og dermed påvirke overflatemodulmålingene.For å studere effekten av sondegeometri og innrykkhastighet på væskeretensjon, ble innrykkkraftkurver plottet for lehfilcon A CL-prøver ved bruk av en 140 nm diameter sonde ved konstante forskyvningshastigheter på 1 µm/s og 2 µm/s.sondediameter 45 µm, fast kraftinnstilling 6 nN oppnådd ved 1 µm/s.Eksperimenter med en sonde 140 nm i diameter ble utført med en innrykkhastighet på 1 µm/s og en innstilt kraft på 300 pN, valgt for å skape et kontakttrykk innenfor det fysiologiske området (1–8 kPa) til det øvre øyelokket.trykk 72. Myke ferdige prøver av PAA-hydrogel med et trykk på 1 kPa ble testet for en inntrykkskraft på 50 pN ved en hastighet på 1 μm/s ved bruk av en sonde med diameter 140 nm.
Siden lengden på den koniske delen av spissen av PFQNM-LC-A-CAL-sonden er omtrent 500 nm, kan det for enhver innrykkdybde < 500 nm trygt antas at geometrien til sonden under innrykk vil forbli tro mot dens kjegleform.I tillegg antas det at overflaten til materialet som testes vil vise en reversibel elastisk respons, som også vil bli bekreftet i de følgende avsnittene.Derfor, avhengig av formen og størrelsen på spissen, valgte vi kjeglekuletilpasningsmodellen utviklet av Briscoe, Sebastian og Adams, som er tilgjengelig i leverandørens programvare, for å behandle våre AFM nanoindentasjonseksperimenter (NanoScope).Separasjonsdataanalyseprogramvare, Bruker) 73. Modellen beskriver kraft-forskyvningsforholdet F(δ) for en kjegle med en sfærisk apex-defekt.På fig.Figur 2 viser kontaktgeometrien under samspillet mellom en stiv kjegle med en sfærisk spiss, der R er radiusen til den sfæriske tuppen, a er kontaktradiusen, b er kontaktradiusen ved enden av den sfæriske tuppen, δ er kontaktradius.innrykkdybde, θ er halvvinkelen til kjeglen.SEM-bildet av denne sonden viser tydelig at den sfæriske spissen med en diameter på 140 nm smelter tangentielt inn i en kjegle, så her er b bare definert gjennom R, dvs. b = R cos θ.Den leverandørleverte programvaren gir et kjegle-sfære-forhold for å beregne Youngs modul (E)-verdier fra kraftseparasjonsdata forutsatt at a > b.Forhold:
hvor F er innrykkkraften, E er Youngs modul, ν er Poissons forhold.Kontaktradius a kan estimeres ved å bruke:
Skjema av kontaktgeometrien til en stiv kjegle med en sfærisk spiss presset inn i materialet til en Lefilcon-kontaktlinse med et overflatelag av forgrenede polymerbørster.
Hvis a ≤ b, reduseres relasjonen til ligningen for en konvensjonell sfærisk indenter;
Vi tror at samspillet mellom innrykkssonden og den forgrenede strukturen til PMPC-polymerbørsten vil føre til at kontaktradiusen a blir større enn den sfæriske kontaktradiusen b.Derfor, for alle kvantitative målinger av elastisitetsmodulen utført i denne studien, brukte vi avhengigheten oppnådd for tilfellet a > b.
De ultramyke biomimetiske materialene som ble studert i denne studien ble omfattende avbildet ved bruk av skanningstransmisjonselektronmikroskopi (STEM) av prøvens tverrsnitt og atomkraftmikroskopi (AFM) av overflaten.Denne detaljerte overflatekarakteriseringen ble utført som en forlengelse av vårt tidligere publiserte arbeid, der vi bestemte at den dynamisk forgrenede polymerbørstestrukturen til den PMPC-modifiserte lehfilcon A CL-overflaten viste lignende mekaniske egenskaper som naturlig hornhinnevev 14 .Av denne grunn omtaler vi kontaktlinseoverflater som biomimetiske materialer14.På fig.3a,b viser tverrsnitt av forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer på overflaten av henholdsvis et lehfilcon A CL-substrat og et ubehandlet SiHy-substrat.Overflatene til begge prøvene ble videre analysert ved hjelp av høyoppløselige AFM-bilder, som ytterligere bekreftet resultatene av STEM-analysen (fig. 3c, d).Til sammen gir disse bildene en omtrentlig lengde på PMPC-forgrenet polymerbørstestruktur ved 300–400 nm, noe som er kritisk for å tolke AFM nanoindentasjonsmålinger.En annen nøkkelobservasjon hentet fra bildene er at den generelle overflatestrukturen til det CL-biomimetiske materialet er morfologisk forskjellig fra SiHy-substratmaterialet.Denne forskjellen i overflatemorfologien deres kan bli tydelig under deres mekaniske interaksjon med den innrykkende AFM-sonden og deretter i de målte modulverdiene.
Tverrsnitts STEM-bilder av (a) lehfilcon A CL og (b) SiHy-substrat.Målestokk, 500 nm.AFM-bilder av overflaten av lehfilcon A CL-substratet (c) og basis SiHy-substratet (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirerte polymerer og polymerbørstestrukturer er iboende myke og har blitt mye studert og brukt i ulike biomedisinske applikasjoner74,75,76,77.Derfor er det viktig å bruke AFM nanoindenteringsmetoden, som nøyaktig og pålitelig kan måle deres mekaniske egenskaper.Men samtidig gjør de unike egenskapene til disse ultramyke materialene, som ekstremt lav elastisitetsmodul, høyt væskeinnhold og høy elastisitet, det ofte vanskelig å velge riktig materiale, form og form på innrykkssonden.størrelse.Dette er viktig slik at innrykkeren ikke trenger gjennom den myke overflaten av prøven, noe som vil føre til feil ved å bestemme kontaktpunktet med overflaten og kontaktområdet.
For dette er en omfattende forståelse av morfologien til ultramyke biomimetiske materialer (lehfilcon A CL) avgjørende.Informasjon om størrelsen og strukturen til de forgrenede polymerbørstene oppnådd ved bruk av bildebehandlingsmetoden gir grunnlaget for den mekaniske karakteriseringen av overflaten ved bruk av AFM nanoindentasjonsteknikker.I stedet for sfæriske kolloidale prober i mikronstørrelse, valgte vi PFQNM-LC-A-CAL silisiumnitridprobe (Bruker) med en spissdiameter på 140 nm, spesielt designet for kvantitativ kartlegging av de mekaniske egenskapene til biologiske prøver 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Begrunnelsen for å bruke relativt skarpe sonder sammenlignet med konvensjonelle kolloidale sonder kan forklares med materialets strukturelle egenskaper.Ved å sammenligne sondespissens størrelse (~140 nm) med de forgrenede polymerbørstene på overflaten av CL lehfilcon A, vist i fig. 3a, kan det konkluderes med at spissen er stor nok til å komme i direkte kontakt med disse børstestrukturene, som reduserer sjansen for at spissen stikker gjennom dem.For å illustrere dette punktet er i fig. 4 et STEM-bilde av lehfilcon A CL og innrykkspissen av AFM-sonden (tegnet i skala).
Skjematisk som viser STEM-bilde av lehfilcon A CL og en ACM-innrykkssonde (tegnet i skala).
I tillegg er spissstørrelsen på 140 nm liten nok til å unngå risikoen for noen av de klebrige ekstruderingseffektene som tidligere er rapportert for polymerbørster produsert av CP-AFM nanoindenteringsmetoden69,71.Vi antar at på grunn av den spesielle kjegle-sfæriske formen og den relativt lille størrelsen til denne AFM-spissen (fig. 1), vil arten av kraftkurven generert av lehfilcon A CL nanoinnrykk ikke avhenge av innrykkhastigheten eller laste-/lossehastigheten .Derfor påvirkes den ikke av porelastiske effekter.For å teste denne hypotesen ble lehfilcon A CL-prøver rykket inn med en fast maksimal kraft ved bruk av en PFQNM-LC-A-CAL-sonde, men med to forskjellige hastigheter, og de resulterende strekk- og tilbaketrekningskraftkurvene ble brukt til å plotte kraften (nN) i separasjon (µm) er vist i figur 5a.Det er tydelig at kraftkurvene under lasting og lossing overlapper fullstendig, og det er ingen klare holdepunkter for at kraftskjærkraften ved null fordypningsdybde øker med innrykkhastigheten i figuren, noe som tyder på at de enkelte børsteelementene ble karakterisert uten en porelastisk effekt.Derimot er væskeretensjonseffekter (viskøs ekstrudering og porelastisitetseffekter) tydelige for AFM-sonden med 45 µm diameter ved samme innrykkhastighet og fremheves av hysteresen mellom streknings- og tilbaketrekningskurvene, som vist i figur 5b.Disse resultatene støtter hypotesen og antyder at 140 nm diameter sonder er et godt valg for å karakterisere slike myke overflater.
lehfilcon A CL innrykk kraftkurver ved bruk av ACM;(a) å bruke en sonde med en diameter på 140 nm ved to belastningshastigheter, som viser fraværet av en porelastisk effekt under overflateinnrykk;(b) bruk av prober med en diameter på 45 µm og 140 nm.s viser effekten av viskøs ekstrudering og porelastisitet for store prober sammenlignet med mindre prober.
For å karakterisere ultramyke overflater, må AFM nanoindentasjonsmetoder ha den beste sonden for å studere egenskapene til materialet som studeres.I tillegg til tuppformen og størrelsen, spiller følsomheten til AFM-detektorsystemet, følsomheten for tuppavbøyning i testmiljøet og utkragingsstivhet en viktig rolle for å bestemme nøyaktigheten og påliteligheten til nanoinnentering.målinger.For vårt AFM-system er deteksjonsgrensen for Position Sensitive Detector (PSD) omtrent 0,5 mV og er basert på den forhåndskalibrerte fjærhastigheten og den beregnede væskeavbøyningsfølsomheten til PFQNM-LC-A-CAL-sonden, som tilsvarer teoretisk lastfølsomhet.er mindre enn 0,1 pN.Derfor tillater denne metoden måling av en minimum innrykkkraft ≤ 0,1 pN uten noen perifer støykomponent.Imidlertid er det nesten umulig for et AFM-system å redusere perifer støy til dette nivået på grunn av faktorer som mekanisk vibrasjon og væskedynamikk.Disse faktorene begrenser den generelle følsomheten til AFM nanoindenteringsmetoden og resulterer også i et bakgrunnsstøysignal på omtrent ≤ 10 pN.For overflatekarakterisering ble lehfilcon A CL- og SiHy-substratprøver rykket inn under fullt hydratiserte forhold ved bruk av en 140 nm sonde for SEM-karakterisering, og de resulterende kraftkurvene ble lagt over kraft (pN) og trykk.Separasjonsplotten (µm) er vist i figur 6a.Sammenlignet med SiHy-basesubstratet viser lehfilcon A CL-kraftkurven tydelig en overgangsfase som starter ved kontaktpunktet med den gaffelformede polymerbørsten og slutter med en skarp endring i skråningsmarkeringskontakten mellom spissen og det underliggende materialet.Denne overgangsdelen av kraftkurven fremhever den virkelig elastiske oppførselen til den forgrenede polymerbørsten på overflaten, noe som fremgår av kompresjonskurven som følger tett spenningskurven og kontrasten i mekaniske egenskaper mellom børstestrukturen og klumpete SiHy-materiale.Når man sammenligner lefilcon.Separasjon av gjennomsnittslengden til en forgrenet polymerbørste i STEM-bildet av PCS (fig. 3a) og kraftkurven langs abscissen i fig. 3a.6a viser at metoden er i stand til å detektere spissen og den forgrenede polymeren som når helt til toppen av overflaten.Kontakt mellom børstestrukturer.I tillegg indikerer tett overlapping av kraftkurvene ingen væskeretensjonseffekt.I dette tilfellet er det absolutt ingen adhesjon mellom nålen og overflaten av prøven.De øverste delene av kraftkurvene for de to prøvene overlapper hverandre, noe som gjenspeiler likheten mellom de mekaniske egenskapene til substratmaterialene.
(a) AFM nanoindentasjonskraftkurver for lehfilcon A CL-substrater og SiHy-substrater, (b) kraftkurver som viser kontaktpunktestimering ved bruk av bakgrunnsstøyterskelmetoden.
For å studere de finere detaljene i kraftkurven, er spenningskurven til lehfilcon A CL-prøven plottet på nytt i fig. 6b med en maksimal kraft på 50 pN langs y-aksen.Denne grafen gir viktig informasjon om den opprinnelige bakgrunnsstøyen.Støyen er i området ±10 pN, som brukes til nøyaktig å bestemme kontaktpunktet og beregne innrykkdybden.Som rapportert i litteraturen, er identifiseringen av kontaktpunkter avgjørende for nøyaktig å vurdere materialegenskaper som modulus85.En tilnærming som involverer automatisk prosessering av kraftkurvedata har vist en forbedret tilpasning mellom datatilpasning og kvantitative målinger for myke materialer86.I dette arbeidet er vårt valg av kontaktpunkter relativt enkelt og objektivt, men det har sine begrensninger.Vår konservative tilnærming til å bestemme kontaktpunktet kan resultere i litt overvurderte modulverdier for mindre innrykkdybder (< 100 nm).Bruken av algoritmebasert berøringspunktdeteksjon og automatisert databehandling kan være en fortsettelse av dette arbeidet i fremtiden for å forbedre metoden vår ytterligere.For iboende bakgrunnsstøy i størrelsesorden ±10 pN, definerer vi kontaktpunktet som det første datapunktet på x-aksen i figur 6b med en verdi på ≥10 pN.Deretter, i samsvar med støyterskelen på 10 pN, markerer en vertikal linje på nivået ~0,27 µm kontaktpunktet med overflaten, hvoretter strekkkurven fortsetter til underlaget møter innrykkdybden på ~270 nm.Interessant nok, basert på størrelsen på de forgrenede polymerbørstefunksjonene (300–400 nm) målt ved hjelp av bildebehandlingsmetoden, er innrykkdybden til CL lehfilcon En prøve observert ved bruk av bakgrunnsstøyterskelmetoden omtrent 270 nm, som er svært nær målestørrelsen med STEM.Disse resultatene bekrefter ytterligere kompatibiliteten og anvendeligheten til formen og størrelsen på AFM-probespissen for innrykk av denne svært myke og svært elastiske forgrenede polymerbørstestrukturen.Disse dataene gir også sterke bevis for å støtte vår metode for å bruke bakgrunnsstøy som en terskel for å finne kontaktpunkter.Derfor bør alle kvantitative resultater oppnådd fra matematisk modellering og kraftkurvetilpasning være relativt nøyaktige.
Kvantitative målinger ved hjelp av AFM nanoindentasjonsmetoder er helt avhengig av de matematiske modellene som brukes for datavalg og påfølgende analyse.Derfor er det viktig å vurdere alle faktorer knyttet til valg av indenter, materialegenskaper og mekanikken i deres interaksjon før du velger en bestemt modell.I dette tilfellet ble spissgeometrien nøye karakterisert ved bruk av SEM-mikrografer (fig. 1), og basert på resultatene er AFM nanoindenting-sonden med en diameter på 140 nm med en hard kjegle og sfærisk spissgeometri et godt valg for å karakterisere lehfilcon A CL79-prøver .En annen viktig faktor som må vurderes nøye er elastisiteten til polymermaterialet som testes.Selv om de første dataene for nanoinnrykk (fig. 5a og 6a) tydelig skisserer egenskapene til overlappingen av strekk- og kompresjonskurvene, dvs. den fullstendige elastiske gjenvinningen av materialet, er det ekstremt viktig å bekrefte den rent elastiske naturen til kontaktene .For dette formål ble to påfølgende innrykk utført på samme sted på overflaten av lehfilcon A CL-prøven med en innrykkhastighet på 1 µm/s under full hydratiseringsbetingelser.De resulterende kraftkurvedataene er vist i fig.7, og som forventet er ekspansjons- og kompresjonskurvene til de to utskriftene nesten identiske, noe som fremhever den høye elastisiteten til den forgrenede polymerbørstestrukturen.
To innrykkkraftkurver på samme sted på overflaten av lehfilcon A CL indikerer den ideelle elastisiteten til linseoverflaten.
Basert på informasjon innhentet fra SEM- og STEM-bilder av henholdsvis sondespissen og lehfilcon A CL-overflaten, er kjeglekulemodellen en rimelig matematisk representasjon av interaksjonen mellom AFM-probespissen og det myke polymermaterialet som testes.I tillegg, for denne kjeglekulemodellen, gjelder de grunnleggende antakelsene om de elastiske egenskapene til det påtrykte materialet for dette nye biomimetiske materialet og brukes til å kvantifisere elastisitetsmodulen.
Etter en omfattende evaluering av AFM nanoindentasjonsmetoden og dens komponenter, inkludert egenskaper for innrykkssonde (form, størrelse og fjærstivhet), sensitivitet (bakgrunnsstøy og kontaktpunktestimering) og datatilpasningsmodeller (kvantitative modulmålinger), ble metoden brukt.karakterisere kommersielt tilgjengelige ultramyke prøver for å verifisere kvantitative resultater.En kommersiell polyakrylamid (PAAM) hydrogel med en elastisitetsmodul på 1 kPa ble testet under hydratiserte forhold ved bruk av en 140 nm sonde.Detaljer om modultesting og beregninger er gitt i tilleggsinformasjonen.Resultatene viste at den målte gjennomsnittlige modulen var 0,92 kPa, og %RSD og prosentvis (%) avvik fra den kjente modulen var mindre enn 10 %.Disse resultatene bekrefter nøyaktigheten og reproduserbarheten til AFM nanoindenteringsmetoden som brukes i dette arbeidet for å måle modulene til ultramyke materialer.Overflatene til lehfilcon A CL-prøvene og SiHy-basesubstratet ble videre karakterisert ved å bruke den samme AFM nanoindentasjonsmetoden for å studere den tilsynelatende kontaktmodulen til den ultramyke overflaten som en funksjon av innrykkdybde.Separasjonskurver for innrykkkraft ble generert for tre prøver av hver type (n = 3; én innrykk per prøve) ved en kraft på 300 pN, en hastighet på 1 µm/s og full hydrering.Innrykkkraftdelingskurven ble tilnærmet ved bruk av en kjeglekulemodell.For å oppnå modul avhengig av innrykkdybde, ble en 40 nm bred del av kraftkurven satt ved hvert trinn på 20 nm fra kontaktpunktet, og målte verdier av modulen ved hvert trinn av kraftkurven.Spin Cy et al.En lignende tilnærming har blitt brukt for å karakterisere modulgradienten til poly(laurylmetakrylat) (P12MA) polymerbørster ved bruk av kolloidal AFM-sonde nanoinnentering, og de er i samsvar med data ved bruk av Hertz-kontaktmodellen.Denne tilnærmingen gir et plott av tilsynelatende kontaktmodul (kPa) versus innrykkdybde (nm), som vist i figur 8, som illustrerer den tilsynelatende kontaktmodulus/dybdegradienten.Den beregnede elastisitetsmodulen til CL lehfilcon A-prøven er i området 2–3 kPa innenfor de øvre 100 nm av prøven, utover dette begynner den å øke med dybden.På den annen side, når du tester SiHy-basesubstratet uten en børstelignende film på overflaten, er den maksimale fordypningsdybden oppnådd ved en kraft på 300 pN mindre enn 50 nm, og modulverdien oppnådd fra dataene er omtrent 400 kPa , som er sammenlignbar med verdiene til Youngs modul for bulkmaterialer.
Tilsynelatende kontaktmodul (kPa) vs. innrykkdybde (nm) for lehfilcon A CL og SiHy substrater ved bruk av AFM nanoindentasjonsmetode med kjeglesfære-geometri for å måle modul.
Den øverste overflaten av den nye biomimetiske forgrenede polymerbørstestrukturen viser en ekstremt lav elastisitetsmodul (2–3 kPa).Dette vil matche den fritthengende enden av den gaffelformede polymerbørsten som vist på STEM-bildet.Selv om det er noen bevis på en modulgradient i ytterkanten av CL, er hovedsubstratet med høy modul mer innflytelsesrik.Imidlertid er de øverste 100 nm av overflaten innenfor 20 % av den totale lengden til den forgrenede polymerbørsten, så det er rimelig å anta at de målte verdiene av modulen i dette innrykkdybdeområdet er relativt nøyaktige og ikke er sterkt avhenge av effekten av bunnobjektet.
På grunn av den unike biomimetiske designen til lehfilcon A-kontaktlinser, bestående av forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer podet på overflaten av SiHy-substrater, er det svært vanskelig å pålitelig karakterisere de mekaniske egenskapene til overflatestrukturene deres ved bruk av tradisjonelle målemetoder.Her presenterer vi en avansert AFM nanoindentasjonsmetode for nøyaktig karakterisering av ultramyke materialer som lefilcon A med høyt vanninnhold og ekstremt høy elastisitet.Denne metoden er basert på bruken av en AFM-sonde hvis spissstørrelse og geometri er nøye valgt for å matche de strukturelle dimensjonene til de ultramyke overflateegenskapene som skal trykkes.Denne kombinasjonen av dimensjoner mellom sonde og struktur gir økt følsomhet, slik at vi kan måle den lave modulen og de iboende elastiske egenskapene til forgrenede polymerbørsteelementer, uavhengig av porelastiske effekter.Resultatene viste at de unike forgrenede PMPC-polymerbørstene som er karakteristiske for linseoverflaten, hadde en ekstremt lav elastisitetsmodul (opptil 2 kPa) og svært høy elastisitet (nesten 100%) når de ble testet i et vannholdig miljø.Resultatene av AFM nanoindentasjon tillot oss også å karakterisere den tilsynelatende kontaktmodulen/dybdegradienten (30 kPa/200 nm) til den biomimetiske linseoverflaten.Denne gradienten kan skyldes modulforskjellen mellom de forgrenede polymerbørstene og SiHy-substratet, eller den forgrenede strukturen/tettheten til polymerbørstene, eller en kombinasjon av disse.Det er imidlertid behov for ytterligere dybdestudier for å fullt ut forstå forholdet mellom struktur og egenskaper, spesielt effekten av børsteforgrening på mekaniske egenskaper.Lignende målinger kan bidra til å karakterisere de mekaniske egenskapene til overflaten til andre ultramyke materialer og medisinsk utstyr.
Datasett generert og/eller analysert i løpet av den nåværende studien er tilgjengelig fra de respektive forfatterne på rimelig forespørsel.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. og Haugen, HJ Biologiske reaksjoner på fysiske og kjemiske egenskaper til overflater av biomaterialer.Kjemisk.samfunn.Ed.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM og Liu, X. Forbedring av menneskeavledede biomaterialer for vevsteknikk.programmering.polymer.vitenskapen.53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al.Design, klinisk implementering og immunrespons av biomaterialer i regenerativ medisin.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK og Farr GM En forbedret metode for å bestemme hardhet og elastisitetsmodul ved bruk av innrykksforsøk med last- og forskyvningsmålinger.J. Alma mater.oppbevaringstank.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historisk opprinnelse til testing av innrykkhardhet.alma mater.vitenskapen.teknologier.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Innrykk hardhetsmålinger på makro-, mikro- og nanoskala: En kritisk gjennomgang.stamme.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD og Clapperich, SM Overflatedeteksjonsfeil fører til moduloverestimering ved nanoinnentering av myke materialer.J. Mecha.Oppførsel.Biomedisinsk vitenskap.alma mater.2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR og Yahya M.Yu.Evaluering av nanoindenteringsmetoden for å bestemme de mekaniske egenskapene til heterogene nanokompositter ved bruk av eksperimentelle og beregningsmetoder.vitenskapen.Hus 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR og Owart, TS Mekanisk karakterisering av myke viskoelastiske geler ved innrykk og optimaliseringsbasert invers finite element-analyse.J. Mecha.Oppførsel.Biomedisinsk vitenskap.alma mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J og Chaneler D. Optimalisering av viskoelastisitetsbestemmelse ved bruk av kompatible målesystemer.Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. og Pellillo, E. Nanoindentation av polymere overflater.J. Fysikk.D. Søk om fysikk.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. og Van Vliet KJ Karakterisering av viskoelastiske mekaniske egenskaper til svært elastiske polymerer og biologiske vev ved bruk av sjokkinnrykk.Journal of Biomaterials.71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluering av elastisitetsmodulen og adhesjonsarbeidet til myke materialer ved bruk av den utvidede Borodich-Galanov (BG) metoden og dyp innrykk.pels.alma mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al.Nanoskala morfologi og mekaniske egenskaper av biomimetiske polymere overflater av silikon hydrogel kontaktlinser.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).