Takk for at du besøker Nature.com. Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig. Bruk Forrige- og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk glidebryterknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Med utviklingen av nye ultramyke materialer for medisinsk utstyr og biomedisinske applikasjoner, er den omfattende karakteriseringen av deres fysiske og mekaniske egenskaper både viktig og utfordrende. En modifisert atomkraftmikroskopi (AFM) nanoindentasjonsteknikk ble brukt for å karakterisere den ekstremt lave overflatemodulen til den nye lehfilcon A biomimetiske silikonhydrogelkontaktlinsen belagt med et lag med forgrenede polymerbørstestrukturer. Denne metoden muliggjør presis bestemmelse av kontaktpunkter uten effekten av viskøs ekstrudering når man nærmer seg forgrenede polymerer. I tillegg gjør den det mulig å bestemme de mekaniske egenskapene til individuelle børsteelementer uten effekten av poroelastisitet. Dette oppnås ved å velge en AFM-probe med en design (spissstørrelse, geometri og fjærhastighet) som er spesielt egnet for å måle egenskapene til myke materialer og biologiske prøver. Denne metoden forbedrer følsomheten og nøyaktigheten for nøyaktig måling av det svært myke materialet lehfilcon A, som har en ekstremt lav elastisitetsmodul på overflatearealet (opptil 2 kPa) og en ekstremt høy elastisitet i det indre (nesten 100 %) vandige miljøet. Resultatene fra overflatestudien avslørte ikke bare de ultramyke overflateegenskapene til lehfilcon A-linsen, men viste også at modulen til de forgrenede polymerbørstene var sammenlignbar med modulen til silisium-hydrogensubstratet. Denne overflatekarakteriseringsteknikken kan brukes på andre ultramyke materialer og medisinsk utstyr.
De mekaniske egenskapene til materialer designet for direkte kontakt med levende vev bestemmes ofte av det biologiske miljøet. Den perfekte matchen av disse materialegenskapene bidrar til å oppnå de ønskede kliniske egenskapene til materialet uten å forårsake ugunstige cellulære responser1,2,3. For homogene bulkmaterialer er karakteriseringen av mekaniske egenskaper relativt enkel på grunn av tilgjengeligheten av standardprosedyrer og testmetoder (f.eks. mikroindentasjon4,5,6). For ultramyke materialer som geler, hydrogeler, biopolymerer, levende celler osv., er imidlertid disse testmetodene generelt ikke anvendelige på grunn av begrensninger i måleoppløsning og inhomogeniteten til noen materialer7. Gjennom årene har tradisjonelle indentasjonsmetoder blitt modifisert og tilpasset for å karakterisere et bredt spekter av myke materialer, men mange metoder lider fortsatt av alvorlige mangler som begrenser bruken av dem8,9,10,11,12,13. Mangelen på spesialiserte testmetoder som nøyaktig og pålitelig kan karakterisere de mekaniske egenskapene til supermyke materialer og overflatelag, begrenser bruken av dem i ulike applikasjoner sterkt.
I vårt tidligere arbeid introduserte vi lehfilcon A (CL) kontaktlinse, et mykt heterogent materiale med alle de ultramyke overflateegenskapene som er avledet fra potensielt biomimetiske design inspirert av overflaten av hornhinnen i øyet. Dette biomaterialet ble utviklet ved å pode et forgrenet, tverrbundet polymerlag av poly(2-metakryloyloxyetylfosforylkolin (MPC)) (PMPC) på en silikonhydrogel (SiHy) 15 designet for medisinsk utstyr basert på. Denne podeprosessen skaper et lag på overflaten som består av en veldig myk og svært elastisk forgrenet polymerbørstestruktur. Vårt tidligere arbeid har bekreftet at den biomimetiske strukturen til lehfilcon A CL gir overlegne overflateegenskaper som forbedret fukting og forebygging av tilsmussing, økt smøreevne og redusert celle- og bakterieadhesjon 15,16. I tillegg antyder bruken og utviklingen av dette biomimetiske materialet også videre ekspansjon til andre biomedisinske apparater. Det er derfor avgjørende å karakterisere overflateegenskapene til dette ultramyke materialet og forstå dets mekaniske interaksjon med øyet for å skape en omfattende kunnskapsbase for å støtte fremtidig utvikling og anvendelser. De fleste kommersielt tilgjengelige SiHy-kontaktlinser er sammensatt av en homogen blanding av hydrofile og hydrofobe polymerer som danner en jevn materialstruktur17. Flere studier har blitt utført for å undersøke deres mekaniske egenskaper ved hjelp av tradisjonelle kompresjons-, strekk- og mikroindentasjonstestmetoder18,19,20,21. Imidlertid gjør den nye biomimetiske designen til lehfilcon A CL det til et unikt heterogent materiale der de mekaniske egenskapene til de forgrenede polymerbørstestrukturene avviker betydelig fra SiHy-basesubstratet. Derfor er det svært vanskelig å kvantifisere disse egenskapene nøyaktig ved hjelp av konvensjonelle og indentasjonsmetoder. En lovende metode bruker nanoindentasjonstestmetoden implementert i atomkraftmikroskopi (AFM), en metode som har blitt brukt til å bestemme de mekaniske egenskapene til myke viskoelastiske materialer som biologiske celler og vev, samt myke polymerer22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. I AFM-nanoindentasjon kombineres det grunnleggende innen nanoindentasjonstesting med de nyeste fremskrittene innen AFM-teknologi for å gi økt målefølsomhet og testing av et bredt spekter av iboende supermyke materialer31,32,33,34,35,36. I tillegg tilbyr teknologien andre viktige fordeler gjennom bruk av forskjellige geometrier, indenter og probe, og muligheten for testing i forskjellige flytende medier.
AFM-nanoindentasjon kan betinget deles inn i tre hovedkomponenter: (1) utstyr (sensorer, detektorer, prober osv.); (2) måleparametere (som kraft, forskyvning, hastighet, rampestørrelse osv.); (3) Databehandling (baselinekorreksjon, berøringspunktestimering, datatilpasning, modellering osv.). Et betydelig problem med denne metoden er at flere studier i litteraturen som bruker AFM-nanoindentasjon rapporterer svært forskjellige kvantitative resultater for samme prøve-/celle-/materialtype37,38,39,40,41. For eksempel, Lekka et al. Innflytelsen av AFM-probegeometri på den målte Youngs modulus av prøver av mekanisk homogene hydrogel- og heterogene celler ble studert og sammenlignet. De rapporterer at modulverdier er sterkt avhengige av valg av utkragning og spissform, med den høyeste verdien for en pyramideformet probe og den laveste verdien på 42 for en sfærisk probe. Tilsvarende, Selhuber-Unkel et al. Det har blitt vist hvordan indentorhastigheten, indentorstørrelsen og tykkelsen på polyakrylamid (PAAM)-prøver påvirker Youngs modul målt med ACM43-nanoindentasjon. En annen kompliserende faktor er mangelen på standard testmaterialer med ekstremt lav modulus og gratis testprosedyrer. Dette gjør det svært vanskelig å få nøyaktige resultater med sikkerhet. Metoden er imidlertid svært nyttig for relative målinger og sammenlignende evalueringer mellom lignende prøvetyper, for eksempel ved bruk av AFM-nanoindentasjon for å skille normale celler fra kreftceller 44, 45.
Når man tester myke materialer med AFM-nanoindentasjon, er en generell tommelfingerregel å bruke en probe med en lav fjærkonstant (k) som samsvarer nøye med prøvemodulen og en halvkuleformet/rund spiss, slik at den første proben ikke gjennomborer prøveoverflatene ved første kontakt med myke materialer. Det er også viktig at avbøyningssignalet som genereres av proben er sterkt nok til å bli oppdaget av laserdetektorsystemet 24,34,46,47. Når det gjelder ultramyke heterogene celler, vev og geler, er en annen utfordring å overvinne klebekraften mellom proben og prøveoverflaten for å sikre reproduserbare og pålitelige målinger 48,49,50. Inntil nylig har det meste av arbeidet med AFM-nanoindentasjon fokusert på studiet av den mekaniske oppførselen til biologiske celler, vev, geler, hydrogeler og biomolekyler ved bruk av relativt store sfæriske prober, ofte referert til som kolloidale prober (CP-er). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Disse spissene har en radius på 1 til 50 µm og er vanligvis laget av borsilikatglass, polymetylmetakrylat (PMMA), polystyren (PS), silisiumdioksid (SiO2) og diamantlignende karbon (DLC). Selv om CP-AFM nanoindentasjon ofte er førstevalget for karakterisering av myke prøver, har det sine egne problemer og begrensninger. Bruken av store, mikronstore sfæriske spisser øker spissens totale kontaktareal med prøven og resulterer i et betydelig tap av romlig oppløsning. For myke, inhomogene prøver, der de mekaniske egenskapene til lokale elementer kan avvike betydelig fra gjennomsnittet over et større område, kan CP-indentasjon skjule eventuell inhomogenitet i egenskaper på lokal skala52. Kolloidale prober lages vanligvis ved å feste mikronstore kolloidale kuler til spissløse utkragninger ved hjelp av epoksylim. Selve produksjonsprosessen er beheftet med mange problemer og kan føre til inkonsekvenser i probekalibreringsprosessen. I tillegg påvirker størrelsen og massen av kolloidale partikler direkte de viktigste kalibreringsparametrene til utkragingen, som resonansfrekvens, fjærstivhet og avbøyningsfølsomhet56,57,58. Dermed kan vanlige metoder for konvensjonelle AFM-prober, som temperaturkalibrering, ikke gi en nøyaktig kalibrering for CP, og andre metoder kan være nødvendige for å utføre disse korreksjonene57, 59, 60, 61. Typiske CP-innrykkeksperimenter bruker store avvik fra utkragingen for å studere egenskapene til myke prøver, noe som skaper et annet problem når man kalibrerer den ikke-lineære oppførselen til utkragingen ved relativt store avvik62,63,64. Moderne kolloidale probeinnrykksmetoder tar vanligvis hensyn til geometrien til utkragingen som brukes til å kalibrere proben, men ignorerer påvirkningen av kolloidale partikler, noe som skaper ytterligere usikkerhet i metodens nøyaktighet38,61. På samme måte er elastisitetsmoduler beregnet ved kontaktmodelltilpasning direkte avhengige av geometrien til innrykksonden, og avvik mellom spiss- og prøveoverflateegenskaper kan føre til unøyaktigheter27, 65, 66, 67, 68. Noe nyere arbeid av Spencer et al. Faktorene som bør tas i betraktning når man karakteriserer myke polymerbørster ved hjelp av CP-AFM nanoindentasjonsmetoden er fremhevet. De rapporterte at retensjonen av en viskøs væske i polymerbørster som en funksjon av hastighet resulterer i en økning i hodebelastning og dermed forskjellige målinger av hastighetsavhengige egenskaper30,69,70,71.
I denne studien har vi karakterisert overflatemodulen til det ultramyke, svært elastiske materialet lehfilcon A CL ved hjelp av en modifisert AFM-nanoindenteringsmetode. Gitt egenskapene og den nye strukturen til dette materialet, er følsomhetsområdet til den tradisjonelle indenteringsmetoden tydelig utilstrekkelig til å karakterisere modulen til dette ekstremt myke materialet, så det er nødvendig å bruke en AFM-nanoindenteringsmetode med høyere følsomhet og lavere følsomhetsnivå. Etter å ha gjennomgått manglene og problemene med eksisterende kolloidale AFM-probe-nanoindenteringsteknikker, viser vi hvorfor vi valgte en mindre, spesialdesignet AFM-probe for å eliminere følsomhet, bakgrunnsstøy, finne kontaktpunkter, måle hastighetsmodulen til myke, heterogene materialer, som væskeretensjonsavhengighet, og kvantifisere nøyaktig. I tillegg var vi i stand til å måle formen og dimensjonene til indenteringsspissen nøyaktig, slik at vi kan bruke kjegle-sfære-tilpasningsmodellen til å bestemme elastisitetsmodulen uten å vurdere spissens kontaktareal med materialet. De to implisitte antagelsene som kvantifiseres i dette arbeidet er de fullt elastiske materialegenskapene og den indenteringsdybdeuavhengige modulen. Ved å bruke denne metoden testet vi først ultramyke standarder med en kjent modulus for å kvantifisere metoden, og deretter brukte vi denne metoden til å karakterisere overflatene til to forskjellige kontaktlinsematerialer. Denne metoden for å karakterisere AFM-nanoindentasjonsoverflater med økt følsomhet forventes å være anvendelig på et bredt spekter av biomimetiske heterogene ultramyke materialer med potensiell bruk i medisinsk utstyr og biomedisinske applikasjoner.
Lehfilcon A-kontaktlinser (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) og deres silikonhydrogelsubstrater ble valgt for nanoindentasjonseksperimenter. En spesialdesignet linsefeste ble brukt i eksperimentet. For å installere linsen for testing ble den forsiktig plassert på det kuppelformede stativet, slik at det ikke kom luftbobler inn i det, og deretter festet med kantene. Et hull i festet øverst på linseholderen gir tilgang til linsens optiske sentrum for nanoindentasjonseksperimenter samtidig som væsken holdes på plass. Dette holder linsene fullstendig hydrert. 500 μl kontaktlinseemballasjeløsning ble brukt som testløsning. For å verifisere de kvantitative resultatene ble kommersielt tilgjengelige ikke-aktiverte polyakrylamid (PAAM) hydrogeler fremstilt fra en polyakrylamid-ko-metylen-bisakrylamid-sammensetning (100 mm Petrisoft Petri-skåler, Matrigen, Irvine, CA, USA), en kjent elastisitetsmodul på 1 kPa. Bruk 4–5 dråper (omtrent 125 µl) fosfatbufret saltvann (PBS fra Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) og 1 dråpe OPTI-FREE Puremoist kontaktlinsevæske (Alcon, Vaud, TX, USA) på AFM-hydrogel-sonde-grensesnittet.
Prøver av Lehfilcon A CL- og SiHy-substrater ble visualisert ved hjelp av et FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM)-system utstyrt med en scanning transmission electron microscope (STEM)-detektor. For å forberede prøvene ble linsene først vasket med vann og kuttet i paiformede kiler. For å oppnå en differensiell kontrast mellom de hydrofile og hydrofobe komponentene i prøvene ble en 0,10 % stabilisert løsning av RuO4 brukt som fargestoff, som prøvene ble nedsenket i i 30 minutter. Lehfilcon A CL RuO4-farging er viktig ikke bare for å oppnå forbedret differensiell kontrast, men bidrar også til å bevare strukturen til de forgrenede polymerbørstene i sin opprinnelige form, som deretter er synlige på STEM-bilder. De ble deretter vasket og dehydrert i en serie etanol/vann-blandinger med økende etanolkonsentrasjon. Prøvene ble deretter støpt med EMBed 812/Araldite-epoksy, som herdet over natten ved 70 °C. Prøveblokker oppnådd ved harpikspolymerisering ble kuttet med en ultramikrotom, og de resulterende tynne snittene ble visualisert med en STEM-detektor i lavvakuummodus ved en akselerasjonsspenning på 30 kV. Det samme SEM-systemet ble brukt for detaljert karakterisering av PFQNM-LC-A-CAL AFM-proben (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). SEM-bilder av AFM-proben ble tatt i en typisk høyvakuummodus med en akselerasjonsspenning på 30 kV. Ta bilder fra forskjellige vinkler og forstørrelser for å registrere alle detaljene om formen og størrelsen på AFM-probespissen. Alle spissdimensjoner av interesse i bildene ble målt digitalt.
Et Dimension FastScan Bio Icon atomkraftmikroskop (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) med «PeakForce QNM in Fluid»-modus ble brukt til å visualisere og nanoindentere lehfilcon A CL-, SiHy-substrat- og PAAm-hydrogelprøver. For avbildningseksperimenter ble en PEAKFORCE-HIRS-FA-probe (Bruker) med en nominell spissradius på 1 nm brukt til å ta høyoppløselige bilder av prøven med en skannehastighet på 0,50 Hz. Alle bildene ble tatt i vandig løsning.
AFM-nanoindentasjonseksperimenter ble utført ved hjelp av en PFQNM-LC-A-CAL-probe (Bruker). AFM-proben har en silisiumspiss på en nitrid-utkragning som er 345 nm tykk, 54 µm lang og 4,5 µm bred med en resonansfrekvens på 45 kHz. Den er spesielt utviklet for å karakterisere og utføre kvantitative nanomekaniske målinger på myke biologiske prøver. Sensorene er individuelt kalibrert på fabrikken med forhåndskalibrerte fjærinnstillinger. Fjærkonstantene til probene som ble brukt i denne studien var i området 0,05–0,1 N/m. For å bestemme formen og størrelsen på spissen nøyaktig, ble proben karakterisert i detalj ved hjelp av SEM. Figur 1a viser et høyoppløselig, lavforstørrelses skanningselektronmikrografi av PFQNM-LC-A-CAL-proben, som gir et helhetlig bilde av probedesignet. Figur 1b viser en forstørret visning av toppen av probespissen, som gir informasjon om formen og størrelsen på spissen. I den ytterste enden er nålen en halvkule med en diameter på omtrent 140 nm (fig. 1c). Under denne smalner spissen av til en konisk form og når en målt lengde på omtrent 500 nm. Utenfor det avsmalnende området er spissen sylindrisk og ender med en total spisslengde på 1,18 µm. Dette er den viktigste funksjonelle delen av probespissen. I tillegg ble en stor sfærisk polystyrenprobe (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) med en spissdiameter på 45 µm og en fjærkonstant på 2 N/m også brukt til testing som en kolloidal probe, med PFQNM-LC-A-CAL 140 nm probe til sammenligning.
Det har blitt rapportert at væske kan bli fanget mellom AFM-sonden og polymerbørstestrukturen under nanoindentering, noe som vil utøve en oppadgående kraft på AFM-sonden før den faktisk berører overflaten69. Denne viskøse ekstruderingseffekten på grunn av væskeretensjon kan endre det tilsynelatende kontaktpunktet, og dermed påvirke overflatemodulmålinger. For å studere effekten av sondens geometri og innrykkshastighet på væskeretensjon, ble innrykkskraftkurver plottet for lehfilcon A CL-prøver ved bruk av en sonde med en diameter på 140 nm ved konstante forskyvningshastigheter på 1 µm/s og 2 µm/s. Sondediameter 45 µm, fast kraftinnstilling 6 nN oppnådd ved 1 µm/s. Eksperimenter med en sonde med en diameter på 140 nm ble utført med en innrykkshastighet på 1 µm/s og en innstilt kraft på 300 pN, valgt for å skape et kontakttrykk innenfor det fysiologiske området (1–8 kPa) for det øvre øyelokket. trykk 72. Myke, ferdiglagde prøver av PAA-hydrogel med et trykk på 1 kPa ble testet for en inntrykkingskraft på 50 pN med en hastighet på 1 μm/s ved bruk av en probe med en diameter på 140 nm.
Siden lengden på den koniske delen av spissen på PFQNM-LC-A-CAL-proben er omtrent 500 nm, kan det for enhver innrykksdybde < 500 nm trygt antas at probens geometri under innrykking vil forbli tro mot sin kjegleform. I tillegg antas det at overflaten på materialet som testes vil utvise en reversibel elastisk respons, noe som også vil bli bekreftet i de følgende avsnittene. Avhengig av formen og størrelsen på spissen valgte vi derfor kjegle-sfære-tilpasningsmodellen utviklet av Briscoe, Sebastian og Adams, som er tilgjengelig i leverandørens programvare, for å behandle våre AFM-nanoindentasjonseksperimenter (NanoScope). Separasjonsdataanalyseprogramvare, Bruker) 73. Modellen beskriver kraft-forskyvningsforholdet F(δ) for en kjegle med en sfærisk apeksdefekt. På fig. Figur 2 viser kontaktgeometrien under samspillet mellom en stiv kjegle og en sfærisk spiss, hvor R er radiusen til den sfæriske spissen, a er kontaktradiusen, b er kontaktradiusen på enden av den sfæriske spissen, δ er kontaktradiusen. Innrykksdybden, θ er halvvinkelen til kjeglen. SEM-bildet av denne sonden viser tydelig at den sfæriske spissen med en diameter på 140 nm går tangentielt over i en kjegle, så her er b kun definert gjennom R, dvs. b = R cos θ. Den leverandørleverte programvaren gir et kjegle-sfære-forhold for å beregne Youngs modulus (E)-verdier fra kraftseparasjonsdata, forutsatt at a > b. Forhold:
hvor F er inntrykkingskraften, E er Youngs modulus og ν er Poissons forhold. Kontaktradiusen a kan estimeres ved å bruke:
Skjema av kontaktgeometrien til en stiv kjegle med en sfærisk spiss presset inn i materialet til en Lefilcon-kontaktlinse med et overflatelag av forgrenede polymerbørster.
Hvis a ≤ b, reduseres relasjonen til ligningen for en konvensjonell sfærisk indentor;
Vi tror at samspillet mellom innrykkproben og den forgrenede strukturen til PMPC-polymerbørsten vil føre til at kontaktradiusen a blir større enn den sfæriske kontaktradiusen b. Derfor brukte vi avhengigheten oppnådd for tilfellet a > b for alle kvantitative målinger av elastisitetsmodulen som ble utført i denne studien.
De ultramyke biomimetiske materialene som ble studert i denne studien ble omfattende avbildet ved hjelp av skanningselektronmikroskopi (STEM) av prøvens tverrsnitt og atomkraftmikroskopi (AFM) av overflaten. Denne detaljerte overflatekarakteriseringen ble utført som en utvidelse av vårt tidligere publiserte arbeid, der vi bestemte at den dynamisk forgrenede polymere børstestrukturen til den PMPC-modifiserte lehfilcon A CL-overflaten viste lignende mekaniske egenskaper som naturlig hornhinnevev 14. Av denne grunn refererer vi til kontaktlinseoverflater som biomimetiske materialer 14. Figur 3a og 3b viser tverrsnitt av forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer på overflaten av henholdsvis et lehfilcon A CL-substrat og et ubehandlet SiHy-substrat. Overflatene til begge prøvene ble videre analysert ved hjelp av AFM-bilder med høy oppløsning, som ytterligere bekreftet resultatene av STEM-analysen (figur 3c og d). Samlet sett gir disse bildene en omtrentlig lengde på den forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturen ved 300–400 nm, noe som er kritisk for å tolke AFM-nanoindentasjonsmålinger. En annen viktig observasjon utledet fra bildene er at den generelle overflatestrukturen til det biomimetiske CL-materialet er morfologisk forskjellig fra SiHy-substratmaterialet. Denne forskjellen i overflatemorfologien kan bli tydelig under deres mekaniske interaksjon med den inntrykkede AFM-sonden og deretter i de målte modulverdiene.
Tverrsnitts-STEM-bilder av (a) lehfilcon A CL og (b) SiHy-substrat. Målestokk, 500 nm. AFM-bilder av overflaten til lehfilcon A CL-substratet (c) og basis-SiHy-substratet (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirerte polymerer og polymerbørstestrukturer er iboende myke og har blitt mye studert og brukt i ulike biomedisinske applikasjoner74,75,76,77. Derfor er det viktig å bruke AFM-nanoindentasjonsmetoden, som kan måle deres mekaniske egenskaper nøyaktig og pålitelig. Men samtidig gjør de unike egenskapene til disse ultramyke materialene, som ekstremt lav elastisitetsmodul, høyt væskeinnhold og høy elastisitet, det ofte vanskelig å velge riktig materiale, form og størrelse på indenteringssonden. Dette er viktig slik at indenteren ikke gjennomborer den myke overflaten av prøven, noe som kan føre til feil i bestemmelsen av kontaktpunktet med overflaten og kontaktområdet.
For dette er en omfattende forståelse av morfologien til ultramyke biomimetiske materialer (lehfilcon A CL) avgjørende. Informasjon om størrelsen og strukturen til de forgrenede polymerbørstene som er oppnådd ved hjelp av avbildningsmetoden, gir grunnlaget for mekanisk karakterisering av overflaten ved hjelp av AFM-nanoindentasjonsteknikker. I stedet for sfæriske kolloidale prober i mikronstørrelse valgte vi PFQNM-LC-A-CAL silisiumnitridproben (Bruker) med en spissdiameter på 140 nm, spesielt designet for kvantitativ kartlegging av de mekaniske egenskapene til biologiske prøver 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Begrunnelsen for å bruke relativt skarpe prober sammenlignet med konvensjonelle kolloidale prober kan forklares med materialets strukturelle egenskaper. Ved å sammenligne probespissens størrelse (~140 nm) med de forgrenede polymerbørstene på overflaten av CL lehfilcon A, vist i figur 3a, kan det konkluderes med at spissen er stor nok til å komme i direkte kontakt med disse børstestrukturene, noe som reduserer sjansen for at spissen trenger gjennom dem. For å illustrere dette poenget er det i figur 4 et STEM-bilde av lehfilcon A CL og den innrykkende spissen på AFM-proben (tegnet i målestokk).
Skjematisk fremstilling av STEM-bilde av lehfilcon A CL og en ACM-innrykkssonde (tegnet i målestokk).
I tillegg er spissstørrelsen på 140 nm liten nok til å unngå risikoen for noen av de klebrige ekstruderingseffektene som tidligere er rapportert for polymerbørster produsert ved CP-AFM nanoindentasjonsmetoden69,71. Vi antar at på grunn av den spesielle koniske-sfæriske formen og den relativt lille størrelsen på denne AFM-spissen (fig. 1), vil kraftkurven som genereres av lehfilcon A CL nanoindentasjon ikke avhenge av indentasjonshastigheten eller laste-/lossehastigheten. Derfor påvirkes den ikke av poroelastiske effekter. For å teste denne hypotesen ble lehfilcon A CL-prøver indentert med en fast maksimal kraft ved hjelp av en PFQNM-LC-A-CAL-probe, men med to forskjellige hastigheter, og de resulterende strekk- og tilbaketrekningskraftkurvene ble brukt til å plotte kraften (nN) i separasjon (µm) som vist i figur 5a. Det er tydelig at kraftkurvene under lasting og lossing overlapper fullstendig, og det finnes ingen klare bevis for at kraftskjæringen ved null innrykksdybde øker med innrykkshastighet i figuren, noe som tyder på at de individuelle børsteelementene ble karakterisert uten en poroelastisk effekt. I motsetning til dette er væskeretensjonseffekter (viskøs ekstrudering og poroelastisitetseffekter) tydelige for AFM-proben med en diameter på 45 µm ved samme innrykkshastighet, og disse fremheves av hysteresen mellom strekk- og tilbaketrekningskurvene, som vist i figur 5b. Disse resultatene støtter hypotesen og antyder at prober med en diameter på 140 nm er et godt valg for å karakterisere slike myke overflater.
lehfilcon A CL-innrykkskraftkurver ved bruk av ACM; (a) bruk av en probe med en diameter på 140 nm ved to belastningshastigheter, som demonstrerer fraværet av en poroelastisk effekt under overflateinnrykk; (b) bruk av prober med en diameter på 45 µm og 140 nm. s viser effektene av viskøs ekstrudering og poroelastisitet for store prober sammenlignet med mindre prober.
For å karakterisere ultramyke overflater må AFM-nanoindentasjonsmetoder ha den beste proben for å studere egenskapene til materialet som studeres. I tillegg til spissform og -størrelse spiller følsomheten til AFM-detektorsystemet, følsomheten for spissavbøyning i testmiljøet og utkragningsstivhet en viktig rolle i å bestemme nøyaktigheten og påliteligheten til nanoindentasjonsmålinger. For vårt AFM-system er deteksjonsgrensen for posisjonsfølsom detektor (PSD) omtrent 0,5 mV og er basert på den forhåndskalibrerte fjærhastigheten og den beregnede væskeavbøyningsfølsomheten til PFQNM-LC-A-CAL-proben, som tilsvarer den teoretiske lastfølsomheten. er mindre enn 0,1 pN. Derfor tillater denne metoden måling av en minimum inntrykkingskraft ≤ 0,1 pN uten noen perifer støykomponent. Det er imidlertid nesten umulig for et AFM-system å redusere perifer støy til dette nivået på grunn av faktorer som mekanisk vibrasjon og væskedynamikk. Disse faktorene begrenser den generelle følsomheten til AFM-nanoindentasjonsmetoden og resulterer også i et bakgrunnsstøysignal på omtrent ≤ 10 pN. For overflatekarakterisering ble lehfilcon A CL- og SiHy-substratprøver innrykket under fullstendig hydrerte forhold ved bruk av en 140 nm probe for SEM-karakterisering, og de resulterende kraftkurvene ble lagt over hverandre mellom kraft (pN) og trykk. Separasjonsplottet (µm) er vist i figur 6a. Sammenlignet med SiHy-basissubstratet viser lehfilcon A CL-kraftkurven tydelig en overgangsfase som starter ved kontaktpunktet med den gaffelformede polymerbørsten og slutter med en skarp endring i helling som markerer kontakten mellom spissen og det underliggende materialet. Denne overgangsdelen av kraftkurven fremhever den virkelig elastiske oppførselen til den forgrenede polymerbørsten på overflaten, noe som fremgår av kompresjonskurven som følger spenningskurven tett og kontrasten i mekaniske egenskaper mellom børstestrukturen og det klumpete SiHy-materialet. Ved sammenligning av lefilcon. Separasjon av gjennomsnittslengden til en forgrenet polymerbørste i STEM-bildet av PCS (fig. 3a) og dens kraftkurve langs abscissen i fig. 3a. 6a viser at metoden er i stand til å oppdage spissen og den forgrenede polymeren som når helt til toppen av overflaten. Kontakt mellom børstestrukturer. I tillegg indikerer tett overlapping av kraftkurvene ingen væskeretensjonseffekt. I dette tilfellet er det absolutt ingen adhesjon mellom nålen og overflaten av prøven. De øverste delene av kraftkurvene for de to prøvene overlapper hverandre, noe som gjenspeiler likheten i de mekaniske egenskapene til substratmaterialene.
(a) AFM nanoindentasjonskraftkurver for lehfilcon A CL-substrater og SiHy-substrater, (b) kraftkurver som viser kontaktpunktestimering ved bruk av bakgrunnsstøyterskelmetoden.
For å studere de finere detaljene i kraftkurven, er spenningskurven til lehfilcon A CL-prøven plottet på nytt i figur 6b med en maksimal kraft på 50 pN langs y-aksen. Denne grafen gir viktig informasjon om den opprinnelige bakgrunnsstøyen. Støyen er i området ±10 pN, som brukes til å bestemme kontaktpunktet nøyaktig og beregne innrykksdybden. Som rapportert i litteraturen, er identifisering av kontaktpunkter avgjørende for å nøyaktig vurdere materialegenskaper som modulus85. En tilnærming som involverer automatisk behandling av kraftkurvedata har vist en forbedret tilpasning mellom datatilpasning og kvantitative målinger for myke materialer86. I dette arbeidet er vårt valg av kontaktpunkter relativt enkelt og objektivt, men det har sine begrensninger. Vår konservative tilnærming til å bestemme kontaktpunktet kan resultere i litt overvurderte modulusverdier for mindre innrykksdybder (< 100 nm). Bruken av algoritmebasert berøringspunktdeteksjon og automatisert databehandling kan være en fortsettelse av dette arbeidet i fremtiden for å forbedre metoden vår ytterligere. For iboende bakgrunnsstøy i størrelsesorden ±10 pN definerer vi derfor kontaktpunktet som det første datapunktet på x-aksen i figur 6b med en verdi på ≥10 pN. Deretter, i samsvar med støyterskelen på 10 pN, markerer en vertikal linje på nivået ~0,27 µm kontaktpunktet med overflaten, hvoretter strekkkurven fortsetter til substratet når innrykksdybden på ~270 nm. Interessant nok, basert på størrelsen på de forgrenede polymerbørstetrekkene (300–400 nm) målt ved hjelp av avbildningsmetoden, er innrykksdybden til CL lehfilcon A-prøven observert ved hjelp av bakgrunnsstøyterskelmetoden omtrent 270 nm, noe som er svært nær målestørrelsen med STEM. Disse resultatene bekrefter ytterligere kompatibiliteten og anvendeligheten av formen og størrelsen på AFM-probespissen for innrykk av denne svært myke og svært elastiske forgrenede polymerbørstestrukturen. Disse dataene gir også sterke bevis for å støtte vår metode for å bruke bakgrunnsstøy som en terskel for å finne kontaktpunkter. Dermed bør eventuelle kvantitative resultater oppnådd fra matematisk modellering og kraftkurvetilpasning være relativt nøyaktige.
Kvantitative målinger med AFM-nanoindentasjonsmetoder er fullstendig avhengige av de matematiske modellene som brukes for datautvelgelse og påfølgende analyse. Derfor er det viktig å vurdere alle faktorer knyttet til valg av indenter, materialegenskaper og mekanikken i deres interaksjon før man velger en bestemt modell. I dette tilfellet ble spissgeometrien nøye karakterisert ved hjelp av SEM-mikrografer (fig. 1), og basert på resultatene er AFM-nanoindentasjonssonden med en diameter på 140 nm, en hard kjegle og sfærisk spissgeometri et godt valg for å karakterisere lehfilcon A CL79-prøver. En annen viktig faktor som må evalueres nøye, er elastisiteten til polymermaterialet som testes. Selv om de innledende dataene for nanoindentasjon (fig. 5a og 6a) tydelig skisserer trekkene ved overlappingen av strekk- og kompresjonskurvene, dvs. den fullstendige elastiske gjenopprettingen av materialet, er det ekstremt viktig å bekrefte den rent elastiske naturen til kontaktene. For dette formålet ble det utført to påfølgende inntrykk på samme sted på overflaten av lehfilcon A CL-prøven med en inntrykkingshastighet på 1 µm/s under fulle hydreringsforhold. De resulterende kraftkurvedataene er vist i figur 7, og som forventet er ekspansjons- og kompresjonskurvene for de to trykkene nesten identiske, noe som fremhever den høye elastisiteten til den forgrenede polymerbørstestrukturen.
To inntrykkingskraftkurver på samme sted på overflaten av lehfilcon A CL indikerer den ideelle elastisiteten til linseoverflaten.
Basert på informasjon hentet fra SEM- og STEM-bilder av henholdsvis probespissen og lehfilcon A CL-overflaten, er konusfæremodellen en rimelig matematisk representasjon av samspillet mellom AFM-probespissen og det myke polymermaterialet som testes. I tillegg gjelder for denne konusfæremodellen de grunnleggende antagelsene om de elastiske egenskapene til det pregede materialet for dette nye biomimetiske materialet, og disse brukes til å kvantifisere elastisitetsmodulen.
Etter en omfattende evaluering av AFM-nanoindentasjonsmetoden og dens komponenter, inkludert egenskaper ved indentasjonssonden (form, størrelse og fjærstivhet), følsomhet (bakgrunnsstøy og kontaktpunktestimering) og datatilpasningsmodeller (kvantitative modulmålinger), ble metoden brukt til å karakterisere kommersielt tilgjengelige ultramyke prøver for å verifisere kvantitative resultater. En kommersiell polyakrylamid (PAAM) hydrogel med en elastisitetsmodul på 1 kPa ble testet under hydrerte forhold ved bruk av en 140 nm probe. Detaljer om modultesting og beregninger finnes i tilleggsinformasjonen. Resultatene viste at den gjennomsnittlige målte modulen var 0,92 kPa, og %RSD og prosentvis (%) avvik fra den kjente modulen var mindre enn 10 %. Disse resultatene bekrefter nøyaktigheten og reproduserbarheten til AFM-nanoindentasjonsmetoden som ble brukt i dette arbeidet for å måle modulene til ultramyke materialer. Overflatene til lehfilcon A CL-prøvene og SiHy-basesubstratet ble videre karakterisert ved bruk av den samme AFM-nanoindentasjonsmetoden for å studere den tilsynelatende kontaktmodulen til den ultramyke overflaten som en funksjon av indentasjonsdybden. Inntrykkskraftseparasjonskurver ble generert for tre prøver av hver type (n = 3; én innrykk per prøve) ved en kraft på 300 pN, en hastighet på 1 µm/s og full hydrering. Innrykkskraftdelingskurven ble tilnærmet ved hjelp av en kjegle-sfæremodell. For å oppnå modulus avhengig av innrykksdybde, ble en 40 nm bred del av kraftkurven satt ved hvert trinn på 20 nm fra kontaktpunktet, og verdier for modulen ble målt ved hvert trinn av kraftkurven. Spin Cy et al. En lignende tilnærming har blitt brukt for å karakterisere modulusgradienten til poly(laurylmetakrylat) (P12MA) polymerbørster ved bruk av kolloidal AFM-probe-nanoindentasjon, og de er konsistente med data ved bruk av Hertz-kontaktmodellen. Denne tilnærmingen gir et plott av tilsynelatende kontaktmodulus (kPa) versus innrykksdybde (nm), som vist i figur 8, som illustrerer den tilsynelatende kontaktmodulus/dybdegradienten. Den beregnede elastisitetsmodulen til CL lehfilcon A-prøven ligger i området 2–3 kPa innenfor de øvre 100 nm av prøven, og utover denne begynner den å øke med dybden. På den annen side, når man tester SiHy-basesubstratet uten en børstelignende film på overflaten, er den maksimale inntrykksdybden som oppnås ved en kraft på 300 pN mindre enn 50 nm, og modulverdien oppnådd fra dataene er omtrent 400 kPa, noe som er sammenlignbart med verdiene til Youngs modulus for bulkmaterialer.
Tilsynelatende kontaktmodul (kPa) vs. inntrykkningsdybde (nm) for lehfilcon A CL- og SiHy-substrater ved bruk av AFM-nanoindentasjonsmetode med konusfæregeometri for å måle modul.
Den øverste overflaten av den nye biomimetiske, forgrenede polymerbørstestrukturen viser en ekstremt lav elastisitetsmodul (2–3 kPa). Dette vil samsvare med den fritthengende enden av den gaffelformede polymerbørsten, som vist på STEM-bildet. Selv om det finnes tegn på en modulgradient ved ytterkanten av CL, er det viktigste substratet med høy modul mer innflytelsesrikt. Imidlertid er de øverste 100 nm av overflaten innenfor 20 % av den totale lengden på den forgrenede polymerbørsten, så det er rimelig å anta at de målte verdiene for modulus i dette innrykksdybdeområdet er relativt nøyaktige og ikke sterkt avhengige av effekten av det nederste objektet.
På grunn av den unike biomimetiske designen til lehfilcon A-kontaktlinser, som består av forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer podet på overflaten av SiHy-substrater, er det svært vanskelig å pålitelig karakterisere de mekaniske egenskapene til overflatestrukturene deres ved hjelp av tradisjonelle målemetoder. Her presenterer vi en avansert AFM-nanoindenteringsmetode for nøyaktig karakterisering av ultramyke materialer som lefilcon A med høyt vanninnhold og ekstremt høy elastisitet. Denne metoden er basert på bruk av en AFM-probe hvis spissstørrelse og geometri er nøye valgt for å matche de strukturelle dimensjonene til de ultramyke overflateegenskapene som skal preges. Denne kombinasjonen av dimensjoner mellom probe og struktur gir økt følsomhet, slik at vi kan måle den lave modulen og de iboende elastisitetsegenskapene til forgrenede polymerbørsteelementer, uavhengig av poroelastiske effekter. Resultatene viste at de unike forgrenede PMPC-polymerbørstene som er karakteristiske for linseoverflaten, hadde en ekstremt lav elastisitetsmodul (opptil 2 kPa) og svært høy elastisitet (nesten 100 %) når de ble testet i et vandig miljø. Resultatene fra AFM-nanoindentasjonen tillot oss også å karakterisere den tilsynelatende kontaktmodulen/dybdegradienten (30 kPa/200 nm) til den biomimetiske linseoverflaten. Denne gradienten kan skyldes modulforskjellen mellom de forgrenede polymerbørstene og SiHy-substratet, eller den forgrenede strukturen/tettheten til polymerbørstene, eller en kombinasjon av disse. Imidlertid er det behov for ytterligere grundige studier for å fullt ut forstå forholdet mellom struktur og egenskaper, spesielt effekten av børsteforgrening på mekaniske egenskaper. Lignende målinger kan bidra til å karakterisere de mekaniske egenskapene til overflaten til andre ultramyke materialer og medisinsk utstyr.
Datasett generert og/eller analysert i løpet av den nåværende studien er tilgjengelige fra de respektive forfatterne på rimelig forespørsel.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. og Haugen, HJ Biologiske reaksjoner på fysiske og kjemiske egenskaper ved overflater av biomaterialer. Chemical. Society. Red. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM og Liu, X. Forbedring av menneskeavledede biomaterialer for vevsteknikk. programmering. polymer. vitenskapen. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Design, klinisk implementering og immunrespons av biomaterialer i regenerativ medisin. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK og Farr GM En forbedret metode for å bestemme hardhet og elastisitetsmodul ved bruk av inntrykkingseksperimenter med last- og forskyvningsmålinger. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historisk opprinnelse til hardhetstesting ved inntrykking. Alma Mater. Vitenskapen. Teknologier. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Målinger av inntrykkshardhet på makro-, mikro- og nanoskala: En kritisk gjennomgang. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD og Clapperich, SM. Feil i overflatedeteksjon fører til overestimering av modulus i nanoindentasjon av myke materialer. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR og Yahya M.Yu. Evaluering av nanoindentasjonsmetoden for å bestemme de mekaniske egenskapene til heterogene nanokompositter ved bruk av eksperimentelle og beregningsmetoder. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, og Owart, TS Mekanisk karakterisering av myke viskoelastiske geler ved innrykk og optimaliseringsbasert invers endelig elementanalyse. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J og Chaneler D. Optimalisering av viskoelastisitetsbestemmelse ved bruk av kompatible målesystemer. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. og Pellillo, E. Nanoindentasjon av polymere overflater. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. og Van Vliet KJ Karakterisering av viskoelastiske mekaniske egenskaper til svært elastiske polymerer og biologisk vev ved bruk av sjokkinnrykk. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluering av elastisitetsmodulen og adhesjonsarbeidet til myke materialer ved bruk av den utvidede Borodich-Galanov (BG)-metoden og dyp innrykk. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Nanoskalamorfologi og mekaniske egenskaper til biomimetiske polymeroverflater av silikonhydrogelkontaktlinser. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).