Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).Dodatkowo, aby zapewnić bieżące wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla karuzelę z trzema slajdami jednocześnie.Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przejść przez trzy slajdy jednocześnie, lub użyj przycisków suwaka na końcu, aby przejść przez trzy slajdy jednocześnie.
Wraz z rozwojem nowych, ultramiękkich materiałów do wyrobów medycznych i zastosowań biomedycznych kompleksowa charakterystyka ich właściwości fizycznych i mechanicznych jest zarówno ważna, jak i wymagająca.Zastosowano zmodyfikowaną technikę nanoindentacji mikroskopii sił atomowych (AFM), aby scharakteryzować wyjątkowo niski moduł powierzchniowy nowych biomimetycznych silikonowo-hydrożelowych soczewek kontaktowych lehfilcon A pokrytych warstwą rozgałęzionych polimerowych struktur szczotkowych.Metoda ta pozwala na precyzyjne określenie punktów styku bez efektu wyciskania lepkiego przy zbliżaniu się do polimerów rozgałęzionych.Dodatkowo umożliwia określenie właściwości mechanicznych poszczególnych elementów szczotki bez wpływu poroelastyczności.Osiąga się to poprzez wybór sondy AFM o konstrukcji (rozmiar końcówki, geometria i sztywność sprężyny), która jest szczególnie odpowiednia do pomiaru właściwości miękkich materiałów i próbek biologicznych.Metoda ta poprawia czułość i dokładność dokładnego pomiaru bardzo miękkiego materiału lehfilcon A, który ma wyjątkowo niski moduł sprężystości na powierzchni (do 2 kPa) i wyjątkowo wysoką elastyczność w wewnętrznym (prawie 100%) środowisku wodnym .Wyniki badań powierzchni nie tylko ujawniły ultramiękkie właściwości powierzchni soczewki lehfilcon A, ale także pokazały, że moduł szczotek z rozgałęzionego polimeru był porównywalny z modułem podłoża krzemowo-wodorowego.Tę technikę charakteryzowania powierzchni można zastosować w przypadku innych ultramiękkich materiałów i wyrobów medycznych.
Właściwości mechaniczne materiałów przeznaczonych do bezpośredniego kontaktu z żywą tkanką są często determinowane przez środowisko biologiczne.Idealne dopasowanie tych właściwości materiału pomaga osiągnąć pożądane właściwości kliniczne materiału bez powodowania niekorzystnych reakcji komórkowych1,2,3.W przypadku materiałów jednorodnych w masie charakterystyka właściwości mechanicznych jest stosunkowo łatwa ze względu na dostępność standardowych procedur i metod badawczych (np. mikroindentacja4,5,6).Jednakże w przypadku ultramiękkich materiałów, takich jak żele, hydrożele, biopolimery, żywe komórki itp., te metody badawcze na ogół nie mają zastosowania ze względu na ograniczoną rozdzielczość pomiaru i niejednorodność niektórych materiałów7.Z biegiem lat tradycyjne metody wgłębiania zostały zmodyfikowane i przystosowane do charakteryzowania szerokiej gamy miękkich materiałów, ale wiele metod nadal ma poważne niedociągnięcia, które ograniczają ich zastosowanie8,9,10,11,12,13.Brak wyspecjalizowanych metod badawczych, które mogłyby dokładnie i niezawodnie scharakteryzować właściwości mechaniczne supermiękkich materiałów i warstw powierzchniowych, poważnie ogranicza ich zastosowanie w różnych zastosowaniach.
W naszej poprzedniej pracy wprowadziliśmy soczewkę kontaktową Lehfilcon A (CL), miękki, heterogeniczny materiał o wszystkich ultramiękkich właściwościach powierzchni, wywodzących się z potencjalnie biomimetycznych projektów inspirowanych powierzchnią rogówki oka.Biomateriał ten powstał poprzez szczepienie rozgałęzionej, usieciowanej warstwy polimerowej poli(2-metakryloiloksyetylofosforylocholiny (MPC)) (PMPC) na hydrożelu silikonowym (SiHy) 15 przeznaczonym do wyrobów medycznych na bazie.Ten proces szczepienia tworzy na powierzchni warstwę składającą się z bardzo miękkiej i wysoce elastycznej, rozgałęzionej polimerowej struktury szczoteczki.Nasze poprzednie prace potwierdziły, że biomimetyczna struktura lehfilconu A CL zapewnia doskonałe właściwości powierzchni, takie jak ulepszone zapobieganie zwilżaniu i osadzaniu się zanieczyszczeń, zwiększoną smarowność oraz zmniejszoną adhezję komórek i bakterii15,16.Ponadto zastosowanie i rozwój tego materiału biomimetycznego sugeruje również dalszą ekspansję na inne urządzenia biomedyczne.Dlatego niezwykle istotne jest scharakteryzowanie właściwości powierzchni tego ultramiękkiego materiału i zrozumienie jego mechanicznej interakcji z okiem, aby stworzyć kompleksową bazę wiedzy wspierającą przyszłe prace rozwojowe i zastosowania.Większość dostępnych na rynku soczewek kontaktowych SiHy składa się z jednorodnej mieszaniny polimerów hydrofilowych i hydrofobowych, które tworzą jednolitą strukturę materiału17.Przeprowadzono kilka badań w celu zbadania ich właściwości mechanicznych przy użyciu tradycyjnych metod testów ściskania, rozciągania i mikrowgnieceń18,19,20,21.Jednakże nowatorska biomimetyczna konstrukcja lehfilcon A CL sprawia, że ​​jest to wyjątkowy heterogeniczny materiał, w którym właściwości mechaniczne struktur szczotkowych rozgałęzionego polimeru znacznie różnią się od właściwości podłoża bazowego SiHy.Dlatego bardzo trudno jest dokładnie określić ilościowo te właściwości metodami konwencjonalnymi i metodą wcięcia.Obiecująca metoda wykorzystuje metodę badania nanoindentacji zaimplementowaną w mikroskopii sił atomowych (AFM), metodę, która została wykorzystana do określenia właściwości mechanicznych miękkich materiałów lepkosprężystych, takich jak komórki i tkanki biologiczne, a także miękkich polimerów22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.W nanoindentacji AFM podstawy testów nanoindentacji łączą się z najnowszymi osiągnięciami technologii AFM, aby zapewnić zwiększoną czułość pomiaru i testowanie szerokiej gamy z natury supermiękkich materiałów31,32,33,34,35,36.Ponadto technologia ta oferuje inne ważne korzyści dzięki zastosowaniu różnych geometrii.wgłębnik i sonda oraz możliwość badania w różnych mediach płynnych.
Nanoindentację AFM można warunkowo podzielić na trzy główne komponenty: (1) sprzęt (czujniki, detektory, sondy itp.);(2) parametry pomiaru (takie jak siła, przemieszczenie, prędkość, wielkość rampy itp.);(3) Przetwarzanie danych (korekta linii bazowej, estymacja punktu dotykowego, dopasowanie danych, modelowanie itp.).Istotnym problemem związanym z tą metodą jest to, że kilka badań w literaturze wykorzystujących nanoindentację AFM podaje bardzo różne wyniki ilościowe dla tego samego typu próbki/komórki/materiału37,38,39,40,41.Na przykład Lekka i in.Zbadano i porównano wpływ geometrii sondy AFM na zmierzony moduł Younga próbek mechanicznie jednorodnych hydrożeli i komórek heterogenicznych.Podają, że wartości modułów w dużym stopniu zależą od wyboru wspornika i kształtu końcówki, przy czym najwyższa wartość jest dla sondy w kształcie piramidy, a najniższa wartość 42 dla sondy sferycznej.Podobnie Selhuber-Unkel i in.Pokazano, jak prędkość wgłębnika, jego wielkość i grubość próbek poliakryloamidu (PAAM) wpływają na moduł Younga mierzony metodą nanoindentacji ACM43.Kolejnym czynnikiem komplikującym jest brak standardowych materiałów testowych o wyjątkowo niskim module i bezpłatnych procedur testowych.To sprawia, że ​​bardzo trudno jest uzyskać dokładne wyniki z pewnością.Jednakże metoda ta jest bardzo przydatna do pomiarów względnych i ocen porównawczych pomiędzy podobnymi typami próbek, na przykład przy użyciu nanoindentacji AFM w celu odróżnienia komórek prawidłowych od komórek nowotworowych 44, 45.
Podczas badania miękkich materiałów za pomocą nanowcięcia AFM ogólną zasadą jest użycie sondy o niskiej stałej sprężystości (k), która jest ściśle dopasowana do modułu próbki i półkulistej/okrągłej końcówki, tak aby pierwsza sonda nie przebiła powierzchni próbki pierwszy kontakt z miękkimi materiałami.Ważne jest również, aby sygnał odchylający generowany przez sondę był wystarczająco silny, aby mógł zostać wykryty przez system detektora laserowego24,34,46,47.W przypadku ultramiękkich heterogenicznych komórek, tkanek i żeli kolejnym wyzwaniem jest pokonanie siły przylegania pomiędzy sondą a powierzchnią próbki, aby zapewnić powtarzalne i wiarygodne pomiary48,49,50.Do niedawna większość prac nad nanoindentacją AFM skupiała się na badaniu mechanicznego zachowania komórek, tkanek, żeli, hydrożeli i biomolekuł biologicznych przy użyciu stosunkowo dużych sond sferycznych, powszechnie nazywanych sondami koloidalnymi (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Końcówki te mają promień od 1 do 50 µm i są zwykle wykonane ze szkła borokrzemowego, polimetakrylanu metylu (PMMA), polistyrenu (PS), dwutlenku krzemu (SiO2) i diamentu jak węgiel (DLC).Chociaż nanoindentacja CP-AFM jest często pierwszym wyborem do charakteryzowania miękkich próbek, ma ona swoje własne problemy i ograniczenia.Zastosowanie dużych końcówek sferycznych o wielkości mikrona zwiększa całkowitą powierzchnię styku końcówki z próbką i skutkuje znaczną utratą rozdzielczości przestrzennej.W przypadku próbek miękkich, niejednorodnych, gdzie właściwości mechaniczne lokalnych pierwiastków mogą znacznie odbiegać od średnich na większym obszarze, wcięcie CP może ukryć wszelkie niejednorodności właściwości w skali lokalnej52.Sondy koloidalne są zwykle wytwarzane poprzez przymocowanie kulek koloidalnych wielkości mikronów do wsporników bez końcówek za pomocą klejów epoksydowych.Sam proces produkcyjny jest obarczony wieloma problemami i może prowadzić do niespójności w procesie kalibracji sondy.Ponadto wielkość i masa cząstek koloidalnych bezpośrednio wpływają na główne parametry kalibracyjne wspornika, takie jak częstotliwość rezonansowa, sztywność sprężyny i czułość na ugięcie56,57,58.Zatem powszechnie stosowane metody dla konwencjonalnych sond AFM, takie jak kalibracja temperatury, mogą nie zapewniać dokładnej kalibracji CP, a do przeprowadzenia tych korekcji mogą być wymagane inne metody 57, 59, 60, 61. Typowe eksperymenty z wgłębieniem CP wykorzystują wsporniki o dużych odchyleniach do badania właściwości miękkich próbek, co stwarza kolejny problem podczas kalibracji nieliniowego zachowania wspornika przy stosunkowo dużych odchyleniach62,63,64.Nowoczesne metody wgłębiania sond koloidalnych zwykle uwzględniają geometrię wspornika użytego do kalibracji sondy, ale ignorują wpływ cząstek koloidalnych, co stwarza dodatkową niepewność co do dokładności metody38,61.Podobnie moduły sprężystości obliczone poprzez dopasowanie modelu kontaktowego są bezpośrednio zależne od geometrii sondy wgłębnej, a niedopasowanie pomiędzy charakterystyką końcówki i powierzchni próbki może prowadzić do niedokładności27, 65, 66, 67, 68. Niektóre niedawne prace Spencera i in.Podkreślono czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy charakteryzowaniu miękkich szczotek polimerowych metodą nanoindentacji CP-AFM.Poinformowali, że zatrzymywanie lepkiego płynu w szczotkach polimerowych w funkcji prędkości powoduje wzrost obciążenia głowicy, a tym samym różne pomiary właściwości zależnych od prędkości30,69,70,71.
W tym badaniu scharakteryzowaliśmy moduł powierzchni ultramiękkiego, wysoce elastycznego materiału lehfilcon A CL, stosując zmodyfikowaną metodę nanoindentacji AFM.Biorąc pod uwagę właściwości i nową strukturę tego materiału, zakres czułości tradycyjnej metody wcięcia jest wyraźnie niewystarczający do scharakteryzowania modułu tego niezwykle miękkiego materiału, dlatego konieczne jest zastosowanie metody nanoindentacji AFM o wyższej i niższej czułości.poziom.Po zapoznaniu się z niedociągnięciami i problemami istniejących technik nanowcięcia sondy koloidalnej AFM pokazujemy, dlaczego wybraliśmy mniejszą, specjalnie zaprojektowaną sondę AFM, aby wyeliminować czułość, szum tła, precyzyjny punkt styku, zmierzyć moduł prędkości miękkich materiałów heterogenicznych, takich jak retencja płynów zależność.i dokładne określenie ilościowe.Dodatkowo udało nam się dokładnie zmierzyć kształt i wymiary końcówki wcięcia, co pozwoliło nam wykorzystać model dopasowania stożkowo-sferycznego do określenia modułu sprężystości bez oceny powierzchni styku końcówki z materiałem.Dwa ukryte założenia, które zostały określone ilościowo w tej pracy, to w pełni elastyczne właściwości materiału i moduł niezależny od głębokości wcięcia.Korzystając z tej metody, najpierw przetestowaliśmy ultramiękkie standardy o znanym module, aby określić ilościowo metodę, a następnie wykorzystaliśmy tę metodę do scharakteryzowania powierzchni dwóch różnych materiałów soczewek kontaktowych.Oczekuje się, że ta metoda charakteryzowania powierzchni nanoindentacji AFM o zwiększonej czułości będzie miała zastosowanie w przypadku szerokiej gamy biomimetycznych heterogenicznych ultramiękkich materiałów o potencjalnym zastosowaniu w wyrobach medycznych i zastosowaniach biomedycznych.
Do eksperymentów z nanoindentacją wybrano soczewki kontaktowe Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Teksas, USA) i ich podłoża silikonowo-hydrożelowe.W eksperymencie wykorzystano specjalnie zaprojektowane mocowanie obiektywu.Aby zainstalować obiektyw do testów, należy go ostrożnie umieścić na kopułkowym stojaku, upewniając się, że do środka nie dostały się pęcherzyki powietrza, a następnie przymocować krawędziami.Otwór w uchwycie w górnej części uchwytu soczewki zapewnia dostęp do środka optycznego soczewki w celu przeprowadzenia eksperymentów z nanoindentacją, przy jednoczesnym utrzymywaniu cieczy na miejscu.Dzięki temu soczewki są w pełni nawilżone.Jako roztwór testowy zastosowano 500 µl roztworu do pakowania soczewek kontaktowych.Aby zweryfikować wyniki ilościowe, przygotowano dostępne w handlu nieaktywowane hydrożele poliakryloamidowe (PAAM) z kompozycji poliakryloamid-kometylen-bisakryloamid (100 mm szalki Petrisoft Petri, Matrigen, Irvine, Kalifornia, USA), o znanym module sprężystości 1 kPa.Użyj 4-5 kropli (około 125 µl) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS z Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) i 1 kroplę roztworu do soczewek kontaktowych OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, Teksas, USA).) na styku hydrożelu-sondy AFM.
Próbki substratów Lehfilcon A CL i SiHy wizualizowano przy użyciu systemu FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM) wyposażonego w detektor Scanning Transmision Electron Microscope (STEM).Aby przygotować próbki, soczewki najpierw przemyto wodą i pocięto na kliny w kształcie koła.Aby uzyskać różnicowy kontrast pomiędzy składnikami hydrofilowymi i hydrofobowymi próbek, jako barwnik zastosowano 0,10% stabilizowany roztwór RuO4, w którym próbki zanurzono na 30 min.Barwienie lehfilcon A CL RuO4 jest ważne nie tylko dla uzyskania lepszego kontrastu różnicowego, ale także pomaga zachować strukturę rozgałęzionych szczotek polimerowych w ich oryginalnej formie, która jest następnie widoczna na obrazach STEM.Następnie przemyto je i odwodniono w serii mieszanin etanol/woda o rosnącym stężeniu etanolu.Próbki następnie odlano żywicą epoksydową EMBed 812/Araldite, która utwardzała się przez noc w temperaturze 70°C.Bloki próbek otrzymane w wyniku polimeryzacji żywicy pocięto za pomocą ultramikrotomu, a powstałe cienkie skrawki wizualizowano za pomocą detektora STEM w trybie niskiej próżni przy napięciu przyspieszającym 30 kV.Ten sam system SEM wykorzystano do szczegółowej charakterystyki sondy PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornia, USA).Obrazy SEM sondy AFM uzyskano w typowym trybie wysokiej próżni przy napięciu przyspieszającym 30 kV.Wykonuj obrazy pod różnymi kątami i przy różnych powiększeniach, aby zarejestrować wszystkie szczegóły kształtu i rozmiaru końcówki sondy AFM.Wszystkie wymiary końcówek interesujące na obrazach zostały zmierzone cyfrowo.
Do wizualizacji i nanoindentacji próbek hydrożelu lehfilcon A CL, substratu SiHy i PAAm wykorzystano mikroskop sił atomowych Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornia, USA) z trybem „PeakForce QNM in Fluid”.Do eksperymentów z obrazowaniem zastosowano sondę PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) o nominalnym promieniu końcówki 1 nm do przechwytywania obrazów próbki o wysokiej rozdzielczości przy częstotliwości skanowania 0,50 Hz.Wszystkie zdjęcia wykonano w roztworze wodnym.
Eksperymenty z nanoindentacją AFM przeprowadzono przy użyciu sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).Sonda AFM ma krzemową końcówkę na wsporniku azotkowym o grubości 345 nm, długości 54 µm i szerokości 4,5 µm, przy częstotliwości rezonansowej 45 kHz.Został specjalnie zaprojektowany do charakteryzowania i wykonywania ilościowych pomiarów nanomechanicznych na miękkich próbkach biologicznych.Czujniki są indywidualnie kalibrowane fabrycznie przy użyciu wstępnie skalibrowanych ustawień sprężyn.Stałe sprężystości sond zastosowanych w badaniach mieściły się w zakresie 0,05–0,1 N/m.Aby dokładnie określić kształt i rozmiar końcówki, sondę szczegółowo scharakteryzowano za pomocą SEM.Na ryc.Ryc. 1a przedstawia skaningową mikrografię elektronową o wysokiej rozdzielczości i małym powiększeniu sondy PFQNM-LC-A-CAL, zapewniającą całościowy obraz konstrukcji sondy.Na ryc.1b przedstawia powiększony widok górnej części końcówki sondy, dostarczający informacji o kształcie i rozmiarze końcówki.Na skrajnym końcu igła ma postać półkuli o średnicy około 140 nm (ryc. 1c).Poniżej końcówka zwęża się w kształt stożkowy, osiągając zmierzoną długość około 500 nm.Poza obszarem zwężającym się końcówka jest cylindryczna i ma całkowitą długość końcówki wynoszącą 1,18 µm.Jest to główna część funkcjonalna końcówki sondy.Dodatkowo do testów jako sondę koloidalną wykorzystano także dużą kulistą sondę polistyrenową (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) o średnicy końcówki 45 µm i stałej sprężystości 2 N/m.dla porównania z sondą PFQNM-LC-A-CAL 140 nm.
Donoszono, że ciecz może zostać uwięziona pomiędzy sondą AFM a strukturą szczotki polimerowej podczas nanowcięcia, co będzie wywierać siłę skierowaną ku górze na sondę AFM, zanim faktycznie dotknie ona powierzchni69.Ten efekt lepkiego wytłaczania spowodowany zatrzymywaniem płynu może zmienić pozorny punkt styku, wpływając w ten sposób na pomiary modułu powierzchni.Aby zbadać wpływ geometrii sondy i szybkości wgłębiania na retencję płynu, wykreślono krzywe siły wcięcia dla próbek lehfilcon A CL przy użyciu sondy o średnicy 140 nm przy stałych szybkościach przemieszczania 1 µm/s i 2 µm/s.średnica sondy 45 µm, stałe ustawienie siły 6 nN osiągane przy 1 µm/s.Eksperymenty z sondą o średnicy 140 nm przeprowadzono przy prędkości wcięcia 1 µm/s i zadanej sile 300 pN, dobranej tak, aby wytworzyć nacisk kontaktowy w zakresie fizjologicznym (1–8 kPa) powieki górnej.ciśnienie 72. Miękkie, gotowe próbki hydrożelu PAA pod ciśnieniem 1 kPa badano pod siłą wcięcia 50 pN przy prędkości 1 µm/s przy użyciu sondy o średnicy 140 nm.
Ponieważ długość stożkowej części końcówki sondy PFQNM-LC-A-CAL wynosi około 500 nm, dla dowolnej głębokości wcięcia < 500 nm można śmiało założyć, że geometria sondy podczas wcięcia pozostanie wierna swojej w kształcie stożka.Dodatkowo zakłada się, że powierzchnia badanego materiału będzie wykazywała odwracalną reakcję sprężystą, co również zostanie potwierdzone w kolejnych rozdziałach.Dlatego też, w zależności od kształtu i rozmiaru końcówki, do przetwarzania naszych eksperymentów z nanoindentacją AFM (NanoScope) wybraliśmy model dopasowania stożka i kuli opracowany przez Briscoe, Sebastiana i Adamsa, który jest dostępny w oprogramowaniu dostawcy.program do analizy danych separacji, Bruker) 73. Model opisuje zależność siła-przemieszczenie F(δ) dla stożka z defektem sferycznego wierzchołka.Na ryc.Rysunek 2 przedstawia geometrię styku podczas oddziaływania sztywnego stożka z kulistą końcówką, gdzie R jest promieniem kulistej końcówki, a jest promieniem styku, b jest promieniem styku na końcu kulistej końcówki, δ jest promień kontaktu.głębokość wcięcia, θ jest półkątem stożka.Obraz SEM tej sondy wyraźnie pokazuje, że kulista końcówka o średnicy 140 nm łączy się stycznie w stożek, więc tutaj b jest definiowane tylko przez R, tj. b = R cos θ.Oprogramowanie dostarczone przez dostawcę zapewnia relację stożek-kula w celu obliczenia wartości modułu Younga (E) na podstawie danych separacji sił, przy założeniu a > b.Relacja:
gdzie F jest siłą wcięcia, E jest modułem Younga, ν jest współczynnikiem Poissona.Promień styku a można oszacować za pomocą:
Schemat geometrii kontaktowej sztywnego stożka z kulistą końcówką wciśniętego w materiał soczewki kontaktowej Lefilcon z warstwą powierzchniową rozgałęzionych szczoteczek polimerowych.
Jeśli a ≤ b, zależność sprowadza się do równania dla konwencjonalnego wgłębnika sferycznego;
Uważamy, że oddziaływanie sondy wgłębnej z rozgałęzioną strukturą szczotki polimerowej PMPC spowoduje, że promień styku a będzie większy niż promień styku sferycznego b.Dlatego też dla wszystkich ilościowych pomiarów modułu sprężystości wykonanych w tym badaniu wykorzystaliśmy zależność uzyskaną dla przypadku a > b.
Ultramiękkie materiały biomimetyczne badane w tym badaniu zostały kompleksowo zobrazowane za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) przekroju poprzecznego próbki i mikroskopii sił atomowych (AFM) powierzchni.Tę szczegółową charakterystykę powierzchni przeprowadzono jako rozszerzenie naszej wcześniej opublikowanej pracy, w której ustaliliśmy, że dynamicznie rozgałęziona polimerowa struktura szczoteczki powierzchni lehfilcon A CL modyfikowanej PMPC wykazuje podobne właściwości mechaniczne do natywnej tkanki rogówki 14 .Z tego powodu powierzchnie soczewek kontaktowych nazywamy materiałami biomimetycznymi14.Na ryc.3a,b przedstawiają przekroje poprzeczne struktur szczotkowych rozgałęzionego polimeru PMPC na powierzchni odpowiednio podłoża Lehfilcon A CL i nieobrobionego podłoża SiHy.Powierzchnie obu próbek poddano dalszej analizie za pomocą obrazów AFM o wysokiej rozdzielczości, co dodatkowo potwierdziło wyniki analizy STEM (ryc. 3c, d).Podsumowując, obrazy te dają przybliżoną długość struktury szczotek z rozgałęzionego polimeru PMPC przy 300–400 nm, co ma kluczowe znaczenie dla interpretacji pomiarów nanoindentacji AFM.Inną kluczową obserwacją wynikającą z obrazów jest to, że ogólna struktura powierzchni materiału biomimetycznego CL różni się morfologicznie od materiału podłoża SiHy.Ta różnica w morfologii ich powierzchni może uwidocznić się podczas ich mechanicznej interakcji z wcinającą sondą AFM, a następnie w zmierzonych wartościach modułu.
Przekrojowe obrazy STEM (a) lehfilcon A CL i (b) podłoża SiHy.Pasek skali, 500 nm.Obrazy AFM powierzchni podłoża lehfilcon A CL (c) i podstawowego podłoża SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polimery inspirowane biologią i struktury szczotek polimerowych są z natury miękkie i były szeroko badane i stosowane w różnych zastosowaniach biomedycznych74,75,76,77.Dlatego istotne jest stosowanie metody nanoindentacji AFM, która pozwala dokładnie i wiarygodnie zmierzyć ich właściwości mechaniczne.Ale jednocześnie unikalne właściwości tych ultramiękkich materiałów, takie jak wyjątkowo niski moduł sprężystości, duża zawartość cieczy i wysoka elastyczność, często utrudniają wybór odpowiedniego materiału, kształtu i kształtu sondy wcinającej.rozmiar.Jest to ważne, aby wgłębnik nie przebił miękkiej powierzchni próbki, co prowadziłoby do błędów w określeniu punktu styku z powierzchnią i powierzchni styku.
W tym celu niezbędne jest wszechstronne zrozumienie morfologii ultramiękkich materiałów biomimetycznych (lehfilcon A CL).Informacje o wielkości i strukturze rozgałęzionych szczotek polimerowych uzyskane metodą obrazowania stanowią podstawę do mechanicznej charakterystyki powierzchni z wykorzystaniem technik nanoindentacji AFM.Zamiast mikronowych sferycznych sond koloidalnych wybraliśmy sondę PFQNM-LC-A-CAL z azotku krzemu (Bruker) o średnicy końcówki 140 nm, specjalnie zaprojektowaną do ilościowego mapowania właściwości mechanicznych próbek biologicznych 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Uzasadnienie stosowania stosunkowo ostrych sond w porównaniu z konwencjonalnymi sondami koloidalnymi można wytłumaczyć cechami strukturalnymi materiału.Porównując wielkość końcówki sondy (~140 nm) ze szczotkami z rozgałęzionego polimeru na powierzchni CL lehfilcon A, pokazaną na rys. 3a, można stwierdzić, że końcówka jest na tyle duża, że ​​może wejść w bezpośredni kontakt z tymi strukturami szczotek, co zmniejsza ryzyko przebicia się końcówki przez nie.Aby zilustrować ten punkt, na ryc. 4 przedstawiono obraz STEM lehfilcona A CL i wcinającej się końcówki sondy AFM (narysowany w skali).
Schemat przedstawiający obraz STEM lehfilcon A CL i sondę wcięcia ACM (narysowany w skali).
Ponadto rozmiar końcówki wynoszący 140 nm jest wystarczająco mały, aby uniknąć ryzyka wystąpienia jakichkolwiek efektów lepkiego wytłaczania opisanych wcześniej w przypadku szczotek polimerowych wytwarzanych metodą nanoindentacji CP-AFM69,71.Zakładamy, że ze względu na specjalny stożkowo-sferyczny kształt i stosunkowo małe rozmiary tej końcówki AFM (rys. 1), charakter krzywej siły generowanej przez nanoindentację lehfilcon A CL nie będzie zależał od prędkości wcięcia ani prędkości ładowania/rozładowywania .Dlatego nie mają na nią wpływu efekty poroelastyczne.Aby przetestować tę hipotezę, próbki lehfilcon A CL wcięto przy ustalonej maksymalnej sile przy użyciu sondy PFQNM-LC-A-CAL, ale przy dwóch różnych prędkościach, a powstałe krzywe siły rozciągania i cofania wykorzystano do wykreślenia siły (nN) w separacji (µm) pokazano na rysunku 5a.Wyraźnie widać, że krzywe siły podczas obciążania i rozładowywania całkowicie się pokrywają i nie ma jednoznacznych dowodów na to, że siła ścinająca przy zerowej głębokości wcięcia wzrasta wraz z prędkością wcięcia na rysunku, co sugeruje, że poszczególne elementy szczoteczki charakteryzowały się brakiem efektu poroelastycznego.Natomiast efekty zatrzymywania płynu (efekty lepkiego wytłaczania i poroelastyczności) są widoczne dla sondy AFM o średnicy 45 µm przy tej samej prędkości wcięcia i są podkreślone przez histerezę między krzywymi rozciągania i cofania, jak pokazano na rysunku 5b.Wyniki te potwierdzają hipotezę i sugerują, że sondy o średnicy 140 nm są dobrym wyborem do charakteryzowania takich miękkich powierzchni.
krzywe siły wcięcia lehfilcon A CL przy użyciu ACM;(a) przy użyciu sondy o średnicy 140 nm przy dwóch prędkościach ładowania, wykazując brak efektu poroelastycznego podczas wcięcia powierzchniowego;b) przy użyciu sond o średnicy 45 µm i 140 nm.pokazują wpływ wytłaczania lepkiego i poroelastyczności dla dużych sond w porównaniu z mniejszymi sondami.
Aby scharakteryzować ultramiękkie powierzchnie, metody nanoindentacji AFM muszą mieć najlepszą sondę do badania właściwości badanego materiału.Oprócz kształtu i rozmiaru końcówki, czułość systemu detektora AFM, wrażliwość na ugięcie końcówki w środowisku testowym oraz sztywność wspornika odgrywają ważną rolę w określaniu dokładności i niezawodności nanoindentacji.pomiary.W przypadku naszego systemu AFM granica wykrywalności detektora wrażliwego na położenie (PSD) wynosi około 0,5 mV i jest oparta na wstępnie skalibrowanym naprężeniu sprężyny i obliczonej czułości na odchylanie płynu sondy PFQNM-LC-A-CAL, która odpowiada teoretyczna wrażliwość na obciążenie.jest mniejsza niż 0,1 pN.Dlatego metoda ta umożliwia pomiar minimalnej siły wcięcia ≤ 0,1 pN bez jakiejkolwiek składowej szumu obwodowego.Jednak prawie niemożliwe jest, aby system AFM zredukował hałas peryferyjny do tego poziomu ze względu na takie czynniki, jak wibracje mechaniczne i dynamika płynów.Czynniki te ograniczają ogólną czułość metody nanoindentacji AFM, a także powodują powstanie sygnału szumu tła o wartości około ≤ 10 pN.W celu scharakteryzowania powierzchni próbki substratów lehfilcon A CL i SiHy wcięto w całkowicie uwodnionych warunkach, stosując sondę 140 nm do charakteryzacji SEM, a powstałe krzywe siły nałożono na siłę (pN) i ciśnienie.Wykres separacji (µm) pokazano na rysunku 6a.W porównaniu z podłożem bazowym SiHy, krzywa siły lehfilcon A CL wyraźnie pokazuje fazę przejściową rozpoczynającą się w punkcie styku z rozwidloną szczotką polimerową i kończącą się ostrą zmianą nachylenia oznaczającego kontakt końcówki z leżącym pod nią materiałem.Ta przejściowa część krzywej siły podkreśla prawdziwie elastyczne zachowanie rozgałęzionej szczotki polimerowej na powierzchni, o czym świadczy krzywa ściskania ściśle odpowiadająca krzywej rozciągania oraz kontrast właściwości mechanicznych pomiędzy strukturą szczotki a nieporęcznym materiałem SiHy.Porównując lefilcon.Oddzielenie średniej długości rozgałęzionej szczotki polimerowej na obrazie STEM PCS (ryc. 3a) i jej krzywej siły wzdłuż odciętej na ryc. 3a.6a pokazuje, że metoda jest w stanie wykryć końcówkę i rozgałęziony polimer sięgający samej góry powierzchni.Kontakt struktur szczotkowych.Ponadto ścisłe nakładanie się krzywych siły wskazuje na brak efektu zatrzymywania cieczy.W tym przypadku nie ma absolutnie żadnego przylegania pomiędzy igłą a powierzchnią próbki.Najwyższe odcinki krzywych sił dla obu próbek pokrywają się, co odzwierciedla podobieństwo właściwości mechanicznych materiałów podłoża.
(a) Krzywe siły nanowcięcia AFM dla podłoży Lehfilcon A CL i podłoży SiHy, (b) krzywe siły pokazujące ocenę punktu kontaktu przy użyciu metody progu szumu tła.
W celu zbadania drobniejszych szczegółów krzywej siły, na ryc. 6b ponownie wykreślono krzywą napięcia próbki lehfilcon A CL przy maksymalnej sile 50 pN wzdłuż osi y.Wykres ten dostarcza ważnych informacji na temat pierwotnego szumu tła.Szum mieści się w zakresie ±10 pN, co służy do dokładnego określenia punktu styku i obliczenia głębokości wcięcia.Jak podaje literatura, identyfikacja punktów styku ma kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny właściwości materiału, takich jak moduł85.Podejście obejmujące automatyczne przetwarzanie danych krzywej siły wykazało lepsze dopasowanie między dopasowaniem danych a pomiarami ilościowymi dla miękkich materiałów86.W tej pracy nasz wybór punktów styku jest stosunkowo prosty i obiektywny, ma jednak swoje ograniczenia.Nasze konserwatywne podejście do wyznaczania punktu styku może skutkować nieco zawyżonymi wartościami modułu dla mniejszych głębokości wcięcia (< 100 nm).Zastosowanie opartego na algorytmach wykrywania punktów kontaktu i automatycznego przetwarzania danych może być kontynuacją tych prac w przyszłości w celu dalszego udoskonalenia naszej metody.Zatem dla wewnętrznego szumu tła rzędu ± 10 pN definiujemy punkt kontaktowy jako pierwszy punkt danych na osi x na rysunku 6b o wartości ≥ 10 pN.Następnie, zgodnie z progiem hałasu wynoszącym 10 pN, pionowa linia na poziomie ~0,27 µm wyznacza punkt styku z powierzchnią, po czym krzywa rozciągania trwa aż do osiągnięcia przez podłoże głębokości wcięcia ~270 nm.Co ciekawe, na podstawie wielkości cech szczoteczki rozgałęzionego polimeru (300–400 nm) zmierzonej metodą obrazowania, głębokość wcięcia próbki CL lehfilcon A obserwowanej metodą progu szumu tła wynosi około 270 nm, co jest bardzo bliskie rozmiar pomiaru za pomocą STEM.Wyniki te dodatkowo potwierdzają zgodność i możliwość zastosowania kształtu i rozmiaru końcówki sondy AFM do wciskania tej bardzo miękkiej i wysoce elastycznej struktury szczoteczki z rozgałęzionego polimeru.Dane te dostarczają również mocnych dowodów na poparcie naszej metody wykorzystania szumu tła jako progu umożliwiającego określenie punktów kontaktowych.Zatem wszelkie wyniki ilościowe uzyskane z modelowania matematycznego i dopasowania krzywej siły powinny być stosunkowo dokładne.
Pomiary ilościowe metodami nanoindentacji AFM są całkowicie zależne od modeli matematycznych stosowanych do selekcji danych i późniejszej analizy.Dlatego przed wyborem konkretnego modelu ważne jest, aby wziąć pod uwagę wszystkie czynniki związane z wyborem wgłębnika, właściwościami materiału i mechaniką ich interakcji.W tym przypadku geometrię końcówki dokładnie scharakteryzowano za pomocą mikrografów SEM (rys. 1) i na podstawie wyników można stwierdzić, że nanoindentująca sonda AFM o średnicy 140 nm z twardym stożkiem i sferyczną geometrią końcówki jest dobrym wyborem do charakteryzowania próbek lehfilcon A CL79 .Innym ważnym czynnikiem, który należy dokładnie ocenić, jest elastyczność testowanego materiału polimerowego.Choć wstępne dane nanoindentacji (rys. 5a i 6a) wyraźnie zarysowują cechy nakładania się krzywych rozciągania i ściskania, czyli całkowitego powrotu sprężystego materiału, niezwykle ważne jest potwierdzenie czysto sprężystego charakteru styków .W tym celu wykonano dwa kolejne wcięcia w tym samym miejscu na powierzchni próbki lehfilcon A CL z szybkością wciskania 1 µm/s w warunkach pełnego uwodnienia.Wynikowe dane dotyczące krzywej siły pokazano na ryc.7 i zgodnie z oczekiwaniami krzywe rozszerzania i ściskania obu nadruków są prawie identyczne, co podkreśla wysoką elastyczność struktury rozgałęzionego polimeru szczotki.
Dwie krzywe siły wcięcia w tym samym miejscu na powierzchni lehfilcon A CL wskazują na idealną elastyczność powierzchni soczewki.
W oparciu o informacje uzyskane z obrazów SEM i STEM odpowiednio końcówki sondy i powierzchni lehfilcon A CL, model stożek-sfera stanowi rozsądną matematyczną reprezentację interakcji pomiędzy końcówką sondy AFM a testowanym miękkim materiałem polimerowym.Ponadto w przypadku tego modelu stożka-kuli podstawowe założenia dotyczące właściwości sprężystych odciskanego materiału są prawdziwe w przypadku tego nowego materiału biomimetycznego i służą do ilościowego określenia modułu sprężystości.
Po kompleksowej ocenie metody nanoindentacji AFM i jej elementów, w tym właściwości sondy wgłębnej (kształt, rozmiar i sztywność sprężyny), czułości (szum tła i estymacja punktu styku) oraz modeli dopasowania danych (ilościowe pomiary modułu), metoda została używany.scharakteryzować dostępne na rynku ultramiękkie próbki w celu weryfikacji wyników ilościowych.Handlowy hydrożel poliakryloamidowy (PAAM) o module sprężystości 1 kPa badano w warunkach uwodnionych przy użyciu sondy 140 nm.Szczegóły testów i obliczeń modułu znajdują się w informacjach uzupełniających.Wyniki wykazały, że średni zmierzony moduł wyniósł 0,92 kPa, a %RSD i procentowe (%) odchylenie od znanego modułu było mniejsze niż 10%.Wyniki te potwierdzają dokładność i powtarzalność zastosowanej w tej pracy metody nanoindentacji AFM do pomiaru modułów ultramiękkich materiałów.Powierzchnie próbek lehfilcon A CL i podłoża bazowego SiHy scharakteryzowano dalej, stosując tę ​​samą metodę nanoindentacji AFM w celu zbadania pozornego modułu kontaktowego ultramiękkiej powierzchni w funkcji głębokości wcięcia.Krzywe separacji siły wcięcia wygenerowano dla trzech próbek każdego typu (n = 3; jedno wcięcie na próbkę) przy sile 300 pN, prędkości 1 µm/s i pełnym uwodnieniu.Krzywą podziału siły wcięcia przybliżono za pomocą modelu stożek-sfera.Aby uzyskać moduł zależny od głębokości wcięcia, ustawiono część krzywej siły o szerokości 40 nm przy każdym przyroście 20 nm, zaczynając od punktu styku, i zmierzono wartości modułu na każdym etapie krzywej siły.Spin Cy i in.Podobne podejście zastosowano do scharakteryzowania gradientu modułu szczotek polimerowych z poli(metakrylanu laurylu) (P12MA) przy użyciu nanowcięcia koloidalnej sondy AFM i jest ono zgodne z danymi uzyskanymi z modelu kontaktowego Hertza.Podejście to zapewnia wykres pozornego modułu kontaktowego (kPa) w funkcji głębokości wcięcia (nm), jak pokazano na rysunku 8, który ilustruje pozorny moduł kontaktowy/gradient głębokości.Obliczony moduł sprężystości próbki CL lehfilcon A mieści się w zakresie 2–3 kPa w górnych 100 nm próbki, powyżej którego zaczyna rosnąć wraz z głębokością.Natomiast podczas badania podłoża bazowego SiHy bez pędzlowej warstwy na powierzchni maksymalna głębokość wcięcia osiągana przy sile 300 pN jest mniejsza niż 50 nm, a wartość modułu uzyskana z danych wynosi około 400 kPa , co jest porównywalne z wartościami modułu Younga dla materiałów sypkich.
Pozorny moduł kontaktowy (kPa) w funkcji głębokości wcięcia (nm) dla podłoży lehfilcon A CL i SiHy przy użyciu metody nanoindentacji AFM z geometrią stożek-sfera do pomiaru modułu.
Najwyższa powierzchnia nowej biomimetycznej struktury szczotek z rozgałęzionego polimeru wykazuje wyjątkowo niski moduł sprężystości (2–3 kPa).Będzie to pasować do swobodnie wiszącego końca rozwidlonej szczotki polimerowej, jak pokazano na obrazie STEM.Chociaż istnieją pewne dowody na gradient modułu na zewnętrznej krawędzi CL, główny substrat o wysokim module ma większy wpływ.Jednakże górne 100 nm powierzchni mieści się w granicach 20% całkowitej długości rozgałęzionej szczotki polimerowej, zatem zasadne jest założenie, że zmierzone wartości modułu w tym zakresie głębokości wcięcia są stosunkowo dokładne i nie silnie zależą od efektu dolnego obiektu.
Ze względu na unikalną biomimetyczną konstrukcję soczewek kontaktowych Lehfilcon A, składających się z rozgałęzionych polimerowych struktur szczoteczek PMPC szczepionych na powierzchni podłoża SiHy, bardzo trudno jest wiarygodnie scharakteryzować właściwości mechaniczne ich struktur powierzchniowych przy użyciu tradycyjnych metod pomiarowych.Tutaj przedstawiamy zaawansowaną metodę nanoindentacji AFM do dokładnego charakteryzowania ultramiękkich materiałów, takich jak lefilcon A, o wysokiej zawartości wody i wyjątkowo wysokiej elastyczności.Metoda ta opiera się na zastosowaniu sondy AFM, której rozmiar końcówki i geometria są starannie dobierane tak, aby odpowiadały wymiarom strukturalnym ultramiękkiej powierzchni, która ma zostać nadrukowana.Ta kombinacja wymiarów sondy i struktury zapewnia zwiększoną czułość, umożliwiając pomiar niskiego modułu i nieodłącznych właściwości elastycznych elementów szczotek z rozgałęzionego polimeru, niezależnie od efektów poroelastycznych.Wyniki wykazały, że charakterystyczne dla powierzchni soczewki unikalne, rozgałęzione szczotki polimerowe PMPC charakteryzują się wyjątkowo niskim modułem sprężystości (do 2 kPa) i bardzo wysoką elastycznością (prawie 100%) podczas testów w środowisku wodnym.Wyniki nanoindentacji AFM pozwoliły nam również scharakteryzować pozorny moduł kontaktowy/gradient głębokości (30 kPa/200 nm) powierzchni soczewki biomimetycznej.Ten gradient może wynikać z różnicy modułów między rozgałęzionymi szczotkami polimerowymi a podłożem SiHy lub z rozgałęzionej struktury/gęstości szczotek polimerowych lub ich kombinacji.Jednakże potrzebne są dalsze, dogłębne badania, aby w pełni zrozumieć związek pomiędzy strukturą a właściwościami, zwłaszcza wpływem rozgałęzienia szczoteczki na właściwości mechaniczne.Podobne pomiary mogą pomóc w scharakteryzowaniu właściwości mechanicznych powierzchni innych ultramiękkich materiałów i wyrobów medycznych.
Zbiory danych wygenerowane i/lub przeanalizowane podczas bieżącego badania są dostępne u odpowiednich autorów na uzasadnione żądanie.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Reakcje biologiczne na właściwości fizyczne i chemiczne powierzchni biomateriałów.Chemiczny.społeczeństwo.wyd.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Udoskonalanie biomateriałów pochodzenia ludzkiego do inżynierii tkankowej.programowanie.polimer.nauka.53, 86 (2016).
Sadtler, K. i in.Projektowanie, zastosowanie kliniczne i odpowiedź immunologiczna biomateriałów w medycynie regeneracyjnej.Narodowy Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Ulepszona metoda wyznaczania twardości i modułu sprężystości za pomocą eksperymentów wcięcia z pomiarami obciążenia i przemieszczenia.J. Alma Mater.Zbiornik.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historyczne początki badań twardości wgłębnej.Alma Mater.nauka.technologie.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Pomiary twardości wcięcia w makro-, mikro- i nanoskali: krytyczny przegląd.plemię.Wrighta.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Błędy wykrywania powierzchni prowadzą do przeszacowania modułu w nanowcięciach miękkich materiałów.J. Mecha.Zachowanie.Nauka Biomedyczna.Alma Mater.2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu.Ocena metody nanoindentacji do wyznaczania właściwości mechanicznych heterogenicznych nanokompozytów metodami doświadczalnymi i obliczeniowymi.nauka.Dom 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR i Owart, TS Mechaniczna charakterystyka miękkich lepkosprężystych żeli za pomocą wcięcia i opartej na optymalizacji odwrotnej analizy elementów skończonych.J. Mecha.Zachowanie.Nauka Biomedyczna.Alma Mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optymalizacja wyznaczania lepkosprężystości przy użyciu kompatybilnych systemów pomiarowych.Miękka materia 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentacja powierzchni polimerowych.J. Fizyka.D. Złóż podanie o fizykę.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Charakterystyka lepkosprężystych właściwości mechanicznych wysoce elastycznych polimerów i tkanek biologicznych za pomocą wcięcia uderzeniowego.Dziennik biomateriałów .71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Ocena modułu sprężystości i pracy przyczepności materiałów miękkich z wykorzystaniem rozszerzonej metody Borodicha-Galanova (BG) i głębokiego wcięcia.futro.Alma Mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. i in.Morfologia w nanoskali i właściwości mechaniczne biomimetycznych powierzchni polimerowych soczewek kontaktowych silikonowo-hydrożelowych.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).