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Com o desenvolvimento de novos materiais ultramacios para dispositivos médicos e aplicações biomédicas, a caracterização abrangente de suas propriedades físicas e mecânicas é importante e desafiadora.Uma técnica de nanoindentação de microscopia de força atômica modificada (AFM) foi aplicada para caracterizar o módulo de superfície extremamente baixo da nova lente de contato lehfilcon A biomimética de silicone hidrogel revestida com uma camada de estruturas de escova de polímero ramificadas.Este método permite a determinação precisa de pontos de contato sem os efeitos da extrusão viscosa ao aproximar polímeros ramificados.Além disso, permite determinar as características mecânicas de elementos individuais da escova sem o efeito da poroelasticidade.Isto é conseguido selecionando uma sonda AFM com um design (tamanho da ponta, geometria e taxa de elasticidade) que é particularmente adequado para medir as propriedades de materiais macios e amostras biológicas.Este método melhora a sensibilidade e a precisão para medição precisa do material muito macio lehfilcon A, que possui um módulo de elasticidade extremamente baixo na área superficial (até 2 kPa) e uma elasticidade extremamente alta no ambiente aquoso interno (quase 100%) .Os resultados do estudo de superfície não apenas revelaram as propriedades superficiais ultramacias da lente lehfilcon A, mas também mostraram que o módulo das escovas de polímero ramificadas era comparável ao do substrato de silício-hidrogênio.Esta técnica de caracterização de superfície pode ser aplicada a outros materiais ultramacios e dispositivos médicos.
As propriedades mecânicas dos materiais projetados para contato direto com tecidos vivos são frequentemente determinadas pelo ambiente biológico.A combinação perfeita dessas propriedades do material ajuda a atingir as características clínicas desejadas do material sem causar respostas celulares adversas1,2,3.Para materiais homogêneos a granel, a caracterização das propriedades mecânicas é relativamente fácil devido à disponibilidade de procedimentos padrão e métodos de teste (por exemplo, microindentação4,5,6).No entanto, para materiais ultramacios, como géis, hidrogéis, biopolímeros, células vivas, etc., esses métodos de teste geralmente não são aplicáveis ​​devido a limitações de resolução de medição e à falta de homogeneidade de alguns materiais7.Ao longo dos anos, os métodos tradicionais de indentação foram modificados e adaptados para caracterizar uma ampla gama de materiais macios, mas muitos métodos ainda sofrem de sérias deficiências que limitam a sua utilização8,9,10,11,12,13.A falta de métodos de teste especializados que possam caracterizar com precisão e confiabilidade as propriedades mecânicas de materiais supermacios e camadas superficiais limita severamente seu uso em diversas aplicações.
Em nosso trabalho anterior, apresentamos a lente de contato lehfilcon A (CL), um material macio e heterogêneo com todas as propriedades de superfície ultramacia derivadas de designs potencialmente biomiméticos inspirados na superfície da córnea do olho.Este biomaterial foi desenvolvido enxertando uma camada polimérica ramificada e reticulada de poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) em um hidrogel de silicone (SiHy) 15 projetado para dispositivos médicos baseados em.Este processo de enxerto cria uma camada na superfície que consiste em uma estrutura de escova polimérica ramificada muito macia e altamente elástica.Nosso trabalho anterior confirmou que a estrutura biomimética do lehfilcon A CL fornece propriedades de superfície superiores, como melhor molhabilidade e prevenção de incrustações, aumento da lubricidade e redução da adesão celular e bacteriana .Além disso, o uso e desenvolvimento deste material biomimético também sugere uma maior expansão para outros dispositivos biomédicos.Portanto, é fundamental caracterizar as propriedades superficiais deste material ultramacio e compreender sua interação mecânica com o olho, a fim de criar uma base de conhecimento abrangente para apoiar futuros desenvolvimentos e aplicações.A maioria das lentes de contato SiHy disponíveis comercialmente são compostas por uma mistura homogênea de polímeros hidrofílicos e hidrofóbicos que formam uma estrutura de material uniforme17.Vários estudos foram realizados para investigar suas propriedades mecânicas utilizando métodos tradicionais de ensaio de compressão, tração e microindentação18,19,20,21.No entanto, o novo design biomimético do lehfilcon A CL torna-o um material heterogêneo único no qual as propriedades mecânicas das estruturas ramificadas da escova polimérica diferem significativamente daquelas do substrato base SiHy.Portanto, é muito difícil quantificar com precisão essas propriedades usando métodos convencionais e de indentação.Um método promissor utiliza o método de teste de nanoindentação implementado em microscopia de força atômica (AFM), um método que tem sido usado para determinar as propriedades mecânicas de materiais viscoelásticos macios, como células e tecidos biológicos, bem como polímeros macios . .,26,27,28,29,30.Na nanoindentação AFM, os fundamentos dos testes de nanoindentação são combinados com os mais recentes avanços na tecnologia AFM para fornecer maior sensibilidade de medição e testes de uma ampla gama de materiais inerentemente supermacios31,32,33,34,35,36.Além disso, a tecnologia oferece outras vantagens importantes através da utilização de diferentes geometrias.penetrador e sonda e possibilidade de teste em diversos meios líquidos.
A nanoindentação AFM pode ser condicionalmente dividida em três componentes principais: (1) equipamentos (sensores, detectores, sondas, etc.);(2) parâmetros de medição (como força, deslocamento, velocidade, tamanho da rampa, etc.);(3) Processamento de dados (correção de linha de base, estimativa de ponto de contato, ajuste de dados, modelagem, etc.).Um problema significativo com este método é que vários estudos na literatura utilizando nanoindentação AFM relatam resultados quantitativos muito diferentes para o mesmo tipo de amostra/célula/material37,38,39,40,41.Por exemplo, Lekka et al.A influência da geometria da sonda AFM no módulo de Young medido de amostras de hidrogel mecanicamente homogêneo e células heterogêneas foi estudada e comparada.Eles relatam que os valores do módulo são altamente dependentes da seleção do cantilever e do formato da ponta, com o valor mais alto para uma sonda em forma de pirâmide e o valor mais baixo de 42 para uma sonda esférica.Da mesma forma, Selhuber-Unkel et al.Foi demonstrado como a velocidade do penetrador, o tamanho do penetrador e a espessura das amostras de poliacrilamida (PAAM) afetam o módulo de Young medido pela nanoindentação ACM43.Outro fator complicador é a falta de materiais de teste padrão de módulo extremamente baixo e procedimentos de teste gratuitos.Isso torna muito difícil obter resultados precisos com confiança.No entanto, o método é muito útil para medições relativas e avaliações comparativas entre tipos de amostras semelhantes, por exemplo, utilizando nanoindentação AFM para distinguir células normais de células cancerígenas 44, 45.
Ao testar materiais macios com nanoindentação AFM, uma regra geral é usar uma sonda com uma constante de mola baixa (k) que corresponda ao módulo da amostra e uma ponta hemisférica/redonda para que a primeira sonda não perfure as superfícies da amostra. primeiro contato com materiais macios.Também é importante que o sinal de deflexão gerado pela sonda seja forte o suficiente para ser detectado pelo sistema detector a laser24,34,46,47.No caso de células, tecidos e géis heterogêneos ultramacios, outro desafio é superar a força adesiva entre a sonda e a superfície da amostra para garantir medições reprodutíveis e confiáveis ​​.Até recentemente, a maior parte dos trabalhos sobre nanoindentação de AFM concentrava-se no estudo do comportamento mecânico de células biológicas, tecidos, géis, hidrogéis e biomoléculas usando sondas esféricas relativamente grandes, comumente chamadas de sondas coloidais (CPs)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Essas pontas têm um raio de 1 a 50 µm e são comumente feitas de vidro borossilicato, polimetilmetacrilato (PMMA), poliestireno (PS), dióxido de silício (SiO2) e diamante. como carbono (DLC).Embora a nanoindentação CP-AFM seja frequentemente a primeira escolha para caracterização de amostras moles, ela tem seus próprios problemas e limitações.O uso de pontas esféricas grandes e de tamanho micrométrico aumenta a área total de contato da ponta com a amostra e resulta em uma perda significativa de resolução espacial.Para amostras moles e não homogêneas, onde as propriedades mecânicas dos elementos locais podem diferir significativamente da média em uma área mais ampla, o recuo CP pode ocultar qualquer falta de homogeneidade nas propriedades em escala local52.As sondas coloidais são normalmente feitas anexando esferas coloidais de tamanho micrométrico a cantilevers sem ponta usando adesivos epóxi.O próprio processo de fabricação está repleto de muitos problemas e pode levar a inconsistências no processo de calibração da sonda.Além disso, o tamanho e a massa das partículas coloidais afetam diretamente os principais parâmetros de calibração do cantilever, como frequência de ressonância, rigidez da mola e sensibilidade à deflexão56,57,58.Assim, métodos comumente usados ​​para sondas AFM convencionais, como calibração de temperatura, podem não fornecer uma calibração precisa para CP, e outros métodos podem ser necessários para realizar essas correções . estudar as propriedades de amostras moles, o que cria outro problema ao calibrar o comportamento não linear do cantilever em desvios relativamente grandes .Os métodos modernos de indentação de sonda coloidal geralmente levam em consideração a geometria do cantilever usado para calibrar a sonda, mas ignoram a influência das partículas coloidais, o que cria incerteza adicional na precisão do método .Da mesma forma, os módulos elásticos calculados pelo ajuste do modelo de contato dependem diretamente da geometria da sonda de indentação, e a incompatibilidade entre as características da ponta e da superfície da amostra pode levar a imprecisões .São destacados os fatores que devem ser levados em consideração na caracterização de pincéis de polímero macio usando o método de nanoindentação CP-AFM.Eles relataram que a retenção de um fluido viscoso em escovas de polímero em função da velocidade resulta em um aumento na carga da cabeça e, portanto, em diferentes medições de propriedades dependentes da velocidade30,69,70,71.
Neste estudo, caracterizamos o módulo de superfície do material ultramacio e altamente elástico lehfilcon A CL usando um método de nanoindentação AFM modificado.Dadas as propriedades e a nova estrutura deste material, a faixa de sensibilidade do método de indentação tradicional é claramente insuficiente para caracterizar o módulo deste material extremamente macio, por isso é necessário utilizar um método de nanoindentação AFM com maior sensibilidade e menor sensibilidade.nível.Depois de revisar as deficiências e problemas das técnicas existentes de nanoindentação de sonda AFM coloidal, mostramos por que escolhemos uma sonda AFM menor e personalizada para eliminar sensibilidade, ruído de fundo, identificar ponto de contato, medir módulo de velocidade de materiais heterogêneos macios, como retenção de fluidos dependência.e quantificação precisa.Além disso, conseguimos medir com precisão o formato e as dimensões da ponta de indentação, permitindo-nos utilizar o modelo de ajuste cone-esfera para determinar o módulo de elasticidade sem avaliar a área de contato da ponta com o material.As duas suposições implícitas quantificadas neste trabalho são as propriedades do material totalmente elástico e o módulo independente da profundidade de indentação.Usando este método, primeiro testamos padrões ultramacios com um módulo conhecido para quantificar o método e, em seguida, usamos esse método para caracterizar as superfícies de dois materiais diferentes de lentes de contato.Espera-se que este método de caracterização de superfícies de nanoindentação AFM com sensibilidade aumentada seja aplicável a uma ampla gama de materiais ultramacios heterogêneos biomiméticos com uso potencial em dispositivos médicos e aplicações biomédicas.
Lentes de contato Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EUA) e seus substratos de hidrogel de silicone foram escolhidos para experimentos de nanoindentação.Uma montagem de lente especialmente projetada foi usada no experimento.Para instalar a lente para teste, ela foi cuidadosamente colocada no suporte em forma de cúpula, certificando-se de que não entrassem bolhas de ar, e depois fixada com as bordas.Um orifício no acessório na parte superior do suporte da lente fornece acesso ao centro óptico da lente para experimentos de nanoindentação enquanto mantém o líquido no lugar.Isso mantém as lentes totalmente hidratadas.500 μl de solução de embalagem de lentes de contato foram utilizados como solução de teste.Para verificar os resultados quantitativos, hidrogéis de poliacrilamida não ativada (PAAM) disponíveis comercialmente foram preparados a partir de uma composição de poliacrilamida-co-metileno-bisacrilamida (placas Petrisoft Petri de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EUA), um módulo de elasticidade conhecido de 1 kPa.Use 4-5 gotas (aproximadamente 125 µl) de solução salina tamponada com fosfato (PBS da Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EUA) e 1 gota de solução para lentes de contato OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EUA).) na interface hidrogel-sonda AFM.
Amostras de substratos Lehfilcon A CL e SiHy foram visualizadas usando um sistema de Microscópio Eletrônico de Varredura de Emissão de Campo FEI Quanta 250 (FEG SEM) equipado com um detector de Microscópio Eletrônico de Transmissão de Varredura (STEM).Para preparar as amostras, as lentes foram primeiro lavadas com água e cortadas em fatias em formato de torta.Para obter um contraste diferencial entre os componentes hidrofílicos e hidrofóbicos das amostras, foi utilizada como corante uma solução estabilizada de RuO4 a 0,10%, na qual as amostras foram imersas por 30 min.A coloração lehfilcon A CL RuO4 é importante não apenas para obter melhor contraste diferencial, mas também ajuda a preservar a estrutura dos pincéis de polímero ramificados em sua forma original, que são então visíveis nas imagens STEM.Eles foram então lavados e desidratados em uma série de misturas de etanol/água com concentração crescente de etanol.As amostras foram então fundidas com epóxi EMBed 812/Araldite, que curou durante a noite a 70°C.Blocos de amostra obtidos por polimerização de resina foram cortados com ultramicrótomo, e as seções finas resultantes foram visualizadas com um detector STEM em modo de baixo vácuo a uma tensão de aceleração de 30 kV.O mesmo sistema SEM foi utilizado para caracterização detalhada da sonda PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Bárbara, CA, EUA).Imagens SEM da sonda AFM foram obtidas em um modo típico de alto vácuo com uma tensão de aceleração de 30 kV.Adquira imagens em diferentes ângulos e ampliações para registrar todos os detalhes da forma e tamanho da ponta da sonda AFM.Todas as dimensões da ponta de interesse nas imagens foram medidas digitalmente.
Um microscópio de força atômica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Bárbara, CA, EUA) com modo “PeakForce QNM in Fluid” foi usado para visualizar e nanoindentar amostras de lehfilcon A CL, substrato SiHy e hidrogel PAAm.Para experimentos de imagem, uma sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) com raio de ponta nominal de 1 nm foi usada para capturar imagens de alta resolução da amostra a uma taxa de varredura de 0,50 Hz.Todas as imagens foram tiradas em solução aquosa.
Experimentos de nanoindentação AFM foram realizados usando uma sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).A sonda AFM possui uma ponta de silício em um cantilever de nitreto de 345 nm de espessura, 54 µm de comprimento e 4,5 µm de largura com frequência de ressonância de 45 kHz.Ele foi projetado especificamente para caracterizar e realizar medições nanomecânicas quantitativas em amostras biológicas moles.Os sensores são calibrados individualmente na fábrica com configurações de mola pré-calibradas.As constantes de mola das sondas utilizadas neste estudo estavam na faixa de 0,05–0,1 N/m.Para determinar com precisão a forma e o tamanho da ponta, a sonda foi caracterizada detalhadamente usando MEV.Na fig.A Figura 1a mostra uma micrografia eletrônica de varredura de alta resolução e baixa ampliação da sonda PFQNM-LC-A-CAL, fornecendo uma visão holística do design da sonda.Na fig.1b mostra uma vista ampliada do topo da ponta da sonda, fornecendo informações sobre o formato e tamanho da ponta.Na extremidade extrema, a agulha é um hemisfério com cerca de 140 nm de diâmetro (Fig. 1c).Abaixo disso, a ponta afunila em formato cônico, atingindo um comprimento medido de aproximadamente 500 nm.Fora da região afilada, a ponta é cilíndrica e termina num comprimento total de ponta de 1,18 µm.Esta é a principal parte funcional da ponta da sonda.Além disso, uma grande sonda esférica de poliestireno (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EUA) com diâmetro de ponta de 45 µm e constante de mola de 2 N/m também foi usada para teste como sonda coloidal.com sonda PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm para comparação.
Foi relatado que o líquido pode ficar preso entre a sonda AFM e a estrutura da escova de polímero durante a nanoindentação, o que exercerá uma força ascendente na sonda AFM antes que ela realmente toque a superfície .Este efeito de extrusão viscosa devido à retenção de fluido pode alterar o ponto de contato aparente, afetando assim as medições do módulo de superfície.Para estudar o efeito da geometria da sonda e da velocidade de indentação na retenção de fluidos, curvas de força de indentação foram traçadas para amostras lehfilcon A CL usando uma sonda de 140 nm de diâmetro a taxas de deslocamento constantes de 1 µm/s e 2 µm/s.diâmetro da sonda 45 µm, configuração de força fixa 6 nN alcançada a 1 µm/s.Experimentos com sonda de 140 nm de diâmetro foram realizados a uma velocidade de indentação de 1 µm/s e uma força definida de 300 pN, escolhida para criar uma pressão de contato dentro da faixa fisiológica (1–8 kPa) da pálpebra superior.pressão 72. Amostras macias prontas de hidrogel PAA com uma pressão de 1 kPa foram testadas para uma força de indentação de 50 pN a uma velocidade de 1 μm/s usando uma sonda com um diâmetro de 140 nm.
Como o comprimento da parte cônica da ponta da sonda PFQNM-LC-A-CAL é de aproximadamente 500 nm, para qualquer profundidade de indentação <500 nm pode-se presumir com segurança que a geometria da sonda durante a indentação permanecerá fiel ao seu formato de cone.Além disso, assume-se que a superfície do material sob teste apresentará uma resposta elástica reversível, o que também será confirmado nas seções seguintes.Portanto, dependendo do formato e tamanho da ponta, escolhemos o modelo de ajuste cone-esfera desenvolvido por Briscoe, Sebastian e Adams, que está disponível no software do fornecedor, para processar nossos experimentos de nanoindentação AFM (NanoScope).Software de análise de dados de separação, Bruker) 73. O modelo descreve a relação força-deslocamento F(δ) para um cone com defeito esférico no ápice.Na fig.A Figura 2 mostra a geometria de contato durante a interação de um cone rígido com uma ponta esférica, onde R é o raio da ponta esférica, a é o raio de contato, b é o raio de contato na extremidade da ponta esférica, δ é o raio de contato.profundidade de recuo, θ é o meio ângulo do cone.A imagem SEM desta sonda mostra claramente que a ponta esférica de 140 nm de diâmetro se funde tangencialmente em um cone, então aqui b é definido apenas através de R, ou seja, b = R cos θ.O software fornecido pelo fornecedor fornece uma relação cone-esfera para calcular os valores do módulo de Young (E) a partir de dados de separação de força, assumindo a > b.Relação:
onde F é a força de indentação, E é o módulo de Young, ν é o índice de Poisson.O raio de contato a pode ser estimado usando:
Esquema da geometria de contato de um cone rígido com ponta esférica pressionada no material de uma lente de contato Lefilcon com uma camada superficial de escovas de polímero ramificadas.
Se a ≤ b, a relação se reduz à equação de um penetrador esférico convencional;
Acreditamos que a interação da sonda de endentação com a estrutura ramificada da escova de polímero PMPC fará com que o raio de contato a seja maior que o raio de contato esférico b.Portanto, para todas as medidas quantitativas do módulo de elasticidade realizadas neste estudo, utilizamos a dependência obtida para o caso a > b.
Os materiais biomiméticos ultramacios estudados neste estudo foram visualizados de forma abrangente usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) da seção transversal da amostra e microscopia de força atômica (AFM) da superfície.Esta caracterização detalhada da superfície foi realizada como uma extensão do nosso trabalho publicado anteriormente, no qual determinamos que a estrutura de escova polimérica dinamicamente ramificada da superfície lehfilcon A CL modificada por PMPC exibia propriedades mecânicas semelhantes às do tecido corneano nativo 14.Por esse motivo, nos referimos às superfícies das lentes de contato como materiais biomiméticos14.Na fig.3a, b mostram seções transversais de estruturas ramificadas de escova de polímero PMPC na superfície de um substrato lehfilcon A CL e um substrato SiHy não tratado, respectivamente.As superfícies de ambas as amostras foram analisadas posteriormente usando imagens AFM de alta resolução, o que confirmou ainda mais os resultados da análise STEM (Fig. 3c, d).Juntas, essas imagens fornecem um comprimento aproximado da estrutura ramificada do pincel de polímero PMPC em 300–400 nm, o que é crítico para a interpretação de medições de nanoindentação de AFM.Outra observação importante derivada das imagens é que a estrutura geral da superfície do material biomimético CL é morfologicamente diferente daquela do material substrato SiHy.Esta diferença na sua morfologia superficial pode tornar-se aparente durante a sua interação mecânica com a sonda AFM de indentação e subsequentemente nos valores de módulo medidos.
Imagens STEM transversais de (a) lehfilcon A CL e (b) substrato SiHy.Barra de escala, 500 nm.Imagens AFM da superfície do substrato lehfilcon A CL (c) e do substrato base SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polímeros bioinspirados e estruturas de escovas poliméricas são inerentemente macios e têm sido amplamente estudados e utilizados em diversas aplicações biomédicas74,75,76,77.Portanto, é importante utilizar o método de nanoindentação AFM, que pode medir com precisão e confiabilidade suas propriedades mecânicas.Mas, ao mesmo tempo, as propriedades únicas desses materiais ultramacios, como módulo de elasticidade extremamente baixo, alto teor de líquido e alta elasticidade, muitas vezes dificultam a escolha do material, formato e formato corretos da sonda de recuo.tamanho.Isto é importante para que o penetrador não perfure a superfície macia da amostra, o que levaria a erros na determinação do ponto de contato com a superfície e da área de contato.
Para isso, é essencial uma compreensão abrangente da morfologia dos materiais biomiméticos ultramacios (lehfilcon A CL).Informações sobre o tamanho e a estrutura das escovas poliméricas ramificadas obtidas pelo método de imagem fornecem a base para a caracterização mecânica da superfície utilizando técnicas de nanoindentação AFM.Em vez de sondas coloidais esféricas de tamanho micrométrico, escolhemos a sonda de nitreto de silício PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) com diâmetro de ponta de 140 nm, especialmente projetada para mapeamento quantitativo das propriedades mecânicas de amostras biológicas 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 A justificativa para o uso de sondas relativamente afiadas em comparação com sondas coloidais convencionais pode ser explicada pelas características estruturais do material.Comparando o tamanho da ponta da sonda (~ 140 nm) com as escovas poliméricas ramificadas na superfície do CL lehfilcon A, mostradas na Fig. 3a, pode-se concluir que a ponta é grande o suficiente para entrar em contato direto com essas estruturas de escova, que reduz a chance de a ponta perfurá-los.Para ilustrar este ponto, na Fig. 4 está uma imagem STEM do lehfilcon A CL e a ponta recortada da sonda AFM (desenhada em escala).
Esquema mostrando imagem STEM de lehfilcon A CL e uma sonda de indentação ACM (desenhada em escala).
Além disso, o tamanho da ponta de 140 nm é pequeno o suficiente para evitar o risco de qualquer um dos efeitos de extrusão pegajosa relatados anteriormente para pincéis de polímero produzidos pelo método de nanoindentação CP-AFM69,71.Assumimos que, devido ao formato cônico-esférico especial e ao tamanho relativamente pequeno desta ponta AFM (Fig. 1), a natureza da curva de força gerada pela nanoindentação lehfilcon A CL não dependerá da velocidade de indentação ou da velocidade de carga/descarga .Portanto, não é afetado pelos efeitos poroelásticos.Para testar esta hipótese, as amostras lehfilcon A CL foram recuadas a uma força máxima fixa usando uma sonda PFQNM-LC-A-CAL, mas em duas velocidades diferentes, e as curvas de força de tração e retração resultantes foram usadas para traçar a força (nN) em separação (µm) é mostrado na Figura 5a.É claro que as curvas de força durante o carregamento e o descarregamento se sobrepõem completamente, e não há evidências claras de que a força de cisalhamento na profundidade de indentação zero aumente com a velocidade de indentação na figura, sugerindo que os elementos de escova individuais foram caracterizados sem efeito poroelástico.Em contraste, os efeitos de retenção de fluidos (extrusão viscosa e efeitos de poroelasticidade) são evidentes para a sonda AFM de 45 µm de diâmetro na mesma velocidade de indentação e são destacados pela histerese entre as curvas de estiramento e retração, como mostrado na Figura 5b.Estes resultados apoiam a hipótese e sugerem que sondas de 140 nm de diâmetro são uma boa escolha para caracterizar tais superfícies macias.
curvas de força de indentação lehfilcon A CL usando ACM;(a) utilização de sonda com diâmetro de 140 nm em duas taxas de carregamento, demonstrando a ausência de efeito poroelástico durante a indentação superficial;(b) utilizando sondas com diâmetro de 45 µm e 140 nm.s mostram os efeitos da extrusão viscosa e da poroelasticidade para sondas grandes em comparação com sondas menores.
Para caracterizar superfícies ultramacias, os métodos de nanoindentação AFM devem ter a melhor sonda para estudar as propriedades do material em estudo.Além do formato e tamanho da ponta, a sensibilidade do sistema detector AFM, a sensibilidade à deflexão da ponta no ambiente de teste e a rigidez do cantilever desempenham um papel importante na determinação da precisão e confiabilidade da nanoindentação.Medidas.Para nosso sistema AFM, o limite de detecção do Detector Sensível à Posição (PSD) é de aproximadamente 0,5 mV e é baseado na taxa de mola pré-calibrada e na sensibilidade de deflexão de fluido calculada da sonda PFQNM-LC-A-CAL, que corresponde ao sensibilidade teórica à carga.é inferior a 0,1 pN.Portanto, este método permite a medição de uma força de indentação mínima ≤ 0,1 pN sem qualquer componente de ruído periférico.No entanto, é quase impossível para um sistema AFM reduzir o ruído periférico a este nível devido a fatores como vibração mecânica e dinâmica de fluidos.Esses fatores limitam a sensibilidade geral do método de nanoindentação AFM e também resultam em um sinal de ruído de fundo de aproximadamente ≤ 10 pN.Para caracterização da superfície, amostras de substrato lehfilcon A CL e SiHy foram recuadas sob condições totalmente hidratadas usando uma sonda de 140 nm para caracterização SEM, e as curvas de força resultantes foram sobrepostas entre força (pN) e pressão.O gráfico de separação (µm) é mostrado na Figura 6a.Em comparação com o substrato base SiHy, a curva de força lehfilcon A CL mostra claramente uma fase de transição começando no ponto de contato com a escova de polímero bifurcada e terminando com uma mudança brusca na inclinação marcando o contato da ponta com o material subjacente.Esta parte de transição da curva de força destaca o comportamento verdadeiramente elástico da escova de polímero ramificada na superfície, como evidenciado pela curva de compressão seguindo de perto a curva de tensão e o contraste nas propriedades mecânicas entre a estrutura da escova e o material SiHy volumoso.Ao comparar lefilcon.Separação do comprimento médio de uma escova de polímero ramificada na imagem STEM do PCS (Fig. 3a) e sua curva de força ao longo da abcissa na Fig.6a mostra que o método é capaz de detectar a ponta e o polímero ramificado atingindo o topo da superfície.Contato entre estruturas de escova.Além disso, a estreita sobreposição das curvas de força indica nenhum efeito de retenção de líquido.Neste caso, não há absolutamente nenhuma adesão entre a agulha e a superfície da amostra.As seções superiores das curvas de força para as duas amostras se sobrepõem, refletindo a semelhança das propriedades mecânicas dos materiais do substrato.
(a) Curvas de força de nanoindentação AFM para substratos lehfilcon A CL e substratos SiHy, (b) curvas de força mostrando estimativa de ponto de contato usando o método de limite de ruído de fundo.
A fim de estudar os detalhes mais sutis da curva de força, a curva de tensão da amostra lehfilcon A CL é plotada novamente na Fig. 6b com uma força máxima de 50 pN ao longo do eixo y.Este gráfico fornece informações importantes sobre o ruído de fundo original.O ruído está na faixa de ±10 pN, que é usado para determinar com precisão o ponto de contato e calcular a profundidade do recuo.Conforme relatado na literatura, a identificação de pontos de contato é crítica para avaliar com precisão as propriedades do material, como o módulo85.Uma abordagem envolvendo processamento automático de dados de curva de força mostrou um ajuste melhorado entre ajuste de dados e medições quantitativas para materiais macios86.Neste trabalho, nossa escolha de pontos de contato é relativamente simples e objetiva, mas tem suas limitações.Nossa abordagem conservadora para determinar o ponto de contato pode resultar em valores de módulo ligeiramente superestimados para profundidades de indentação menores (<100 nm).O uso de detecção de ponto de contato baseada em algoritmo e processamento automatizado de dados poderia ser uma continuação deste trabalho no futuro para melhorar ainda mais nosso método.Assim, para ruído de fundo intrínseco da ordem de ±10 pN, definimos o ponto de contato como o primeiro ponto de dados no eixo x na Figura 6b com um valor ≥10 pN.Então, de acordo com o limite de ruído de 10 pN, uma linha vertical no nível de ~0,27 µm marca o ponto de contato com a superfície, após o que a curva de alongamento continua até que o substrato atinja a profundidade de recuo de ~270 nm.Curiosamente, com base no tamanho das características do pincel de polímero ramificado (300–400 nm) medido usando o método de imagem, a profundidade de indentação da amostra CL lehfilcon A observada usando o método de limite de ruído de fundo é de cerca de 270 nm, o que é muito próximo de o tamanho da medição com STEM.Estes resultados confirmam ainda mais a compatibilidade e aplicabilidade da forma e tamanho da ponta da sonda AFM para indentação desta estrutura de escova de polímero ramificada muito macia e altamente elástica.Esses dados também fornecem fortes evidências para apoiar nosso método de usar o ruído de fundo como limite para identificar pontos de contato.Assim, quaisquer resultados quantitativos obtidos a partir da modelagem matemática e do ajuste da curva de força devem ser relativamente precisos.
As medições quantitativas pelos métodos de nanoindentação AFM são completamente dependentes dos modelos matemáticos utilizados para seleção de dados e posterior análise.Portanto, é importante considerar todos os fatores relacionados à escolha do penetrador, às propriedades do material e à mecânica de sua interação antes de escolher um modelo específico.Neste caso, a geometria da ponta foi cuidadosamente caracterizada usando micrografias SEM (Fig. 1) e, com base nos resultados, a sonda de nanoindentação AFM de 140 nm de diâmetro com cone duro e geometria de ponta esférica é uma boa escolha para caracterizar amostras de lehfilcon A CL79 .Outro fator importante que precisa ser avaliado cuidadosamente é a elasticidade do material polimérico que está sendo testado.Embora os dados iniciais da nanoindentação (Figs. 5a e 6a) delineiem claramente as características da sobreposição das curvas de tensão e compressão, ou seja, a recuperação elástica completa do material, é extremamente importante confirmar a natureza puramente elástica dos contatos .Para este fim, foram realizadas duas indentações sucessivas no mesmo local na superfície da amostra lehfilcon A CL a uma taxa de indentação de 1 µm/s sob condições de hidratação total.Os dados da curva de força resultante são mostrados na fig.7 e, como esperado, as curvas de expansão e compressão das duas impressões são quase idênticas, destacando a alta elasticidade da estrutura ramificada do pincel polimérico.
Duas curvas de força de indentação no mesmo local na superfície do lehfilcon A CL indicam a elasticidade ideal da superfície da lente.
Com base nas informações obtidas a partir de imagens SEM e STEM da ponta da sonda e da superfície lehfilcon A CL, respectivamente, o modelo cone-esfera é uma representação matemática razoável da interação entre a ponta da sonda AFM e o material polimérico macio sendo testado.Além disso, para este modelo cone-esfera, as suposições fundamentais sobre as propriedades elásticas do material impresso são verdadeiras para este novo material biomimético e são usadas para quantificar o módulo elástico.
Após uma avaliação abrangente do método de nanoindentação AFM e seus componentes, incluindo propriedades da sonda de indentação (forma, tamanho e rigidez da mola), sensibilidade (ruído de fundo e estimativa de ponto de contato) e modelos de ajuste de dados (medições quantitativas de módulo), o método foi usado.caracterizar amostras ultramacias disponíveis comercialmente para verificar resultados quantitativos.Um hidrogel comercial de poliacrilamida (PAAM) com módulo de elasticidade de 1 kPa foi testado sob condições hidratadas usando uma sonda de 140 nm.Detalhes dos testes e cálculos do módulo são fornecidos nas Informações Suplementares.Os resultados mostraram que o módulo médio medido foi de 0,92 kPa, e o %RSD e o desvio percentual (%) do módulo conhecido foram inferiores a 10%.Estes resultados confirmam a precisão e reprodutibilidade do método de nanoindentação AFM utilizado neste trabalho para medir os módulos de materiais ultramacios.As superfícies das amostras lehfilcon A CL e do substrato base SiHy foram ainda caracterizadas usando o mesmo método de nanoindentação AFM para estudar o módulo de contato aparente da superfície ultramacia em função da profundidade de indentação.Curvas de separação da força de indentação foram geradas para três amostras de cada tipo (n = 3; uma indentação por amostra) a uma força de 300 pN, velocidade de 1 µm/s e hidratação total.A curva de compartilhamento de força de indentação foi aproximada usando um modelo cone-esfera.Para obter o módulo dependente da profundidade de indentação, uma porção de 40 nm de largura da curva de força foi definida em cada incremento de 20 nm a partir do ponto de contato, e valores medidos do módulo em cada etapa da curva de força.Spin Cy et al.Uma abordagem semelhante foi usada para caracterizar o gradiente de módulo de escovas de polímero de poli (metacrilato de laurila) (P12MA) usando nanoindentação de sonda AFM coloidal, e elas são consistentes com os dados usando o modelo de contato Hertz.Esta abordagem fornece um gráfico do módulo de contato aparente (kPa) versus profundidade de indentação (nm), conforme mostrado na Figura 8, que ilustra o módulo de contato aparente/gradiente de profundidade.O módulo de elasticidade calculado da amostra CL lehfilcon A está na faixa de 2–3 kPa nos 100 nm superiores da amostra, além dos quais começa a aumentar com a profundidade.Por outro lado, ao testar o substrato base SiHy sem um filme tipo pincel na superfície, a profundidade máxima de indentação alcançada a uma força de 300 pN é inferior a 50 nm, e o valor do módulo obtido a partir dos dados é de cerca de 400 kPa , que é comparável aos valores do módulo de Young para materiais a granel.
Módulo de contato aparente (kPa) vs. profundidade de indentação (nm) para substratos lehfilcon A CL e SiHy usando o método de nanoindentação AFM com geometria de esfera cônica para medir o módulo.
A superfície superior da nova estrutura de escova de polímero ramificado biomimético exibe um módulo de elasticidade extremamente baixo (2–3 kPa).Isso corresponderá à extremidade livre da escova bifurcada de polímero, conforme mostrado na imagem STEM.Embora haja alguma evidência de um gradiente de módulo na borda externa do CL, o principal substrato de alto módulo é mais influente.No entanto, os 100 nm superiores da superfície estão dentro de 20% do comprimento total da escova de polímero ramificada, portanto, é razoável assumir que os valores medidos do módulo nesta faixa de profundidade de indentação são relativamente precisos e não fortemente dependem do efeito do objeto inferior.
Devido ao design biomimético exclusivo das lentes de contato lehfilcon A, consistindo em estruturas ramificadas de escova de polímero PMPC enxertadas na superfície de substratos SiHy, é muito difícil caracterizar de forma confiável as propriedades mecânicas de suas estruturas superficiais usando métodos de medição tradicionais.Aqui apresentamos um método avançado de nanoindentação AFM para caracterizar com precisão materiais ultramacios, como o lefilcon A, com alto teor de água e elasticidade extremamente alta.Este método é baseado no uso de uma sonda AFM cujo tamanho e geometria da ponta são cuidadosamente escolhidos para corresponder às dimensões estruturais das características da superfície ultramacia a serem impressas.Esta combinação de dimensões entre a sonda e a estrutura proporciona maior sensibilidade, permitindo-nos medir o baixo módulo e as propriedades elásticas inerentes dos elementos de escova de polímero ramificado, independentemente dos efeitos poroelásticos.Os resultados mostraram que as escovas de polímero PMPC ramificadas exclusivas, características da superfície da lente, tinham um módulo de elasticidade extremamente baixo (até 2 kPa) e uma elasticidade muito alta (quase 100%) quando testadas em ambiente aquoso.Os resultados da nanoindentação AFM também nos permitiram caracterizar o aparente módulo de contato/gradiente de profundidade (30 kPa/200 nm) da superfície da lente biomimética.Este gradiente pode ser devido à diferença de módulo entre as escovas de polímero ramificadas e o substrato SiHy, ou à estrutura/densidade ramificada das escovas de polímero, ou uma combinação destes.No entanto, são necessários estudos mais aprofundados para compreender completamente a relação entre estrutura e propriedades, especialmente o efeito da ramificação da escova nas propriedades mecânicas.Medições semelhantes podem ajudar a caracterizar as propriedades mecânicas da superfície de outros materiais ultramacios e dispositivos médicos.
Os conjuntos de dados gerados e/ou analisados ​​durante o presente estudo estão disponíveis aos respectivos autores mediante solicitação razoável.
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