Tack för att du besöker Nature.com. Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). För att säkerställa fortsatt support visar vi dessutom webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Visar en karusell med tre bilder samtidigt. Använd knapparna Föregående och Nästa för att bläddra igenom tre bilder åt gången, eller använd skjutreglageknapparna i slutet för att bläddra igenom tre bilder åt gången.
Med utvecklingen av nya ultramjuka material för medicintekniska produkter och biomedicinska tillämpningar är den omfattande karakteriseringen av deras fysikaliska och mekaniska egenskaper både viktig och utmanande. En modifierad atomkraftsmikroskopi (AFM) nanoindenteringsteknik användes för att karakterisera den extremt låga ytmodulen hos den nya lehfilcon A biomimetiska silikonhydrogelkontaktlinsen belagd med ett lager av grenade polymerborststrukturer. Denna metod möjliggör exakt bestämning av kontaktpunkter utan effekterna av viskös extrudering när man närmar sig grenade polymerer. Dessutom gör den det möjligt att bestämma de mekaniska egenskaperna hos enskilda borstelement utan effekten av poroelasticitet. Detta uppnås genom att välja en AFM-sond med en design (spetsstorlek, geometri och fjäderkonstant) som är särskilt lämplig för att mäta egenskaperna hos mjuka material och biologiska prover. Denna metod förbättrar känsligheten och noggrannheten för noggrann mätning av det mycket mjuka materialet lehfilcon A, som har en extremt låg elasticitetsmodul på ytan (upp till 2 kPa) och en extremt hög elasticitet i den interna (nästan 100 %) vattenmiljön. Resultaten av ytstudien avslöjade inte bara de ultramjuka ytegenskaperna hos lehfilcon A-linsen, utan visade också att modulen hos de grenade polymerborstarna var jämförbar med den hos kisel-vätesubstratet. Denna ytkarakteriseringsteknik kan tillämpas på andra ultramjuka material och medicintekniska produkter.
De mekaniska egenskaperna hos material avsedda för direkt kontakt med levande vävnad bestäms ofta av den biologiska miljön. Den perfekta matchningen av dessa materialegenskaper hjälper till att uppnå materialets önskade kliniska egenskaper utan att orsaka negativa cellulära reaktioner1,2,3. För homogena bulkmaterial är karakteriseringen av mekaniska egenskaper relativt enkel på grund av tillgången till standardprocedurer och testmetoder (t.ex. mikroindentation4,5,6). För ultramjuka material som geler, hydrogeler, biopolymerer, levande celler etc. är dessa testmetoder dock i allmänhet inte tillämpliga på grund av begränsningar i mätupplösningen och inhomogeniteten hos vissa material7. Under årens lopp har traditionella indentationsmetoder modifierats och anpassats för att karakterisera ett brett spektrum av mjuka material, men många metoder lider fortfarande av allvarliga brister som begränsar deras användning8,9,10,11,12,13. Bristen på specialiserade testmetoder som noggrant och tillförlitligt kan karakterisera de mekaniska egenskaperna hos supermjuka material och ytskikt begränsar deras användning i olika tillämpningar allvarligt.
I vårt tidigare arbete introducerade vi lehfilcon A (CL) kontaktlinser, ett mjukt heterogent material med alla de ultramjuka ytegenskaper som härrör från potentiellt biomimetiska designer inspirerade av ögats hornhinna. Detta biomaterial utvecklades genom att ympa ett grenat, tvärbundet polymerlager av poly(2-metakryloxyetylfosforylkolin (MPC)) (PMPC) på en silikonhydrogel (SiHy) 15 designad för medicintekniska produkter baserad på. Denna ympningsprocess skapar ett lager på ytan bestående av en mycket mjuk och mycket elastisk grenad polymerborststruktur. Vårt tidigare arbete har bekräftat att den biomimetiska strukturen hos lehfilcon A CL ger överlägsna ytegenskaper såsom förbättrad vätning och nedsmutsningsförebyggande, ökad smörjförmåga och minskad cell- och bakterievidhäftning 15,16. Dessutom tyder användningen och utvecklingen av detta biomimetiska material också på ytterligare expansion till andra biomedicinska produkter. Det är därför avgörande att karakterisera ytegenskaperna hos detta ultramjuka material och förstå dess mekaniska interaktion med ögat för att skapa en omfattande kunskapsbas för att stödja framtida utvecklingar och tillämpningar. De flesta kommersiellt tillgängliga SiHy-kontaktlinser består av en homogen blandning av hydrofila och hydrofoba polymerer som bildar en enhetlig materialstruktur17. Flera studier har genomförts för att undersöka deras mekaniska egenskaper med hjälp av traditionella kompressions-, drag- och mikroindentationstestmetoder18,19,20,21. Den nya biomimetiska designen av lehfilcon A CL gör det dock till ett unikt heterogent material där de mekaniska egenskaperna hos de grenade polymerborststrukturerna skiljer sig avsevärt från SiHy-bassubstratet. Därför är det mycket svårt att exakt kvantifiera dessa egenskaper med konventionella metoder och indentationsmetoder. En lovande metod använder nanoindentationstestmetoden som implementerats i atomkraftsmikroskopi (AFM), en metod som har använts för att bestämma de mekaniska egenskaperna hos mjuka viskoelastiska material såsom biologiska celler och vävnader, såväl som mjuka polymerer22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. Vid AFM-nanoindentation kombineras grunderna för nanoindentationstestning med de senaste framstegen inom AFM-teknik för att ge ökad mätkänslighet och testning av ett brett spektrum av naturligt supermjuka material31,32,33,34,35,36. Dessutom erbjuder tekniken andra viktiga fördelar genom användningen av olika geometrier, indenter och prob, samt möjligheten att testa i olika flytande medier.
AFM-nanoindentation kan villkorligt delas in i tre huvudkomponenter: (1) utrustning (sensorer, detektorer, sonder, etc.); (2) mätparametrar (såsom kraft, förskjutning, hastighet, rampstorlek, etc.); (3) Databehandling (baslinjekorrigering, beröringspunktsuppskattning, dataanpassning, modellering, etc.). Ett betydande problem med denna metod är att flera studier i litteraturen som använder AFM-nanoindentation rapporterar mycket olika kvantitativa resultat för samma prov-/cell-/materialtyp37,38,39,40,41. Till exempel, Lekka et al. Inverkan av AFM-sondgeometri på den uppmätta Youngs modul hos prover av mekaniskt homogena hydrogel- och heterogena celler studerades och jämfördes. De rapporterar att modulvärdena är starkt beroende av val av utkragning och spetsform, med det högsta värdet för en pyramidformad sond och det lägsta värdet på 42 för en sfärisk sond. På liknande sätt, Selhuber-Unkel et al. Det har visats hur indenterarens hastighet, indenterarens storlek och tjocklek hos polyakrylamid (PAAM)-prover påverkar Youngs modul mätt med ACM43-nanoindentation. En annan komplicerande faktor är bristen på standardmaterial för test med extremt låg modul och fria testprocedurer. Detta gör det mycket svårt att få exakta resultat med säkerhet. Metoden är dock mycket användbar för relativa mätningar och jämförande utvärderingar mellan liknande provtyper, till exempel med hjälp av AFM-nanoindentation för att skilja normala celler från cancerceller 44, 45.
Vid testning av mjuka material med AFM-nanoindentation är en allmän tumregel att använda en prob med en låg fjäderkonstant (k) som nära matchar provmodulen och en halvklotformad/rund spets så att den första proben inte tränger igenom provytorna vid första kontakten med mjuka material. Det är också viktigt att avböjningssignalen som genereras av proben är tillräckligt stark för att detekteras av laserdetektorsystemet 24,34,46,47. När det gäller ultramjuka heterogena celler, vävnader och geler är en annan utmaning att övervinna vidhäftningskraften mellan proben och provytan för att säkerställa reproducerbara och tillförlitliga mätningar 48,49,50. Fram till nyligen har det mesta arbetet med AFM-nanoindentation fokuserat på studier av det mekaniska beteendet hos biologiska celler, vävnader, geler, hydrogeler och biomolekyler med hjälp av relativt stora sfäriska prober, vanligtvis kallade kolloidala prober (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Dessa spetsar har en radie på 1 till 50 µm och är vanligtvis tillverkade av borsilikatglas, polymetylmetakrylat (PMMA), polystyren (PS), kiseldioxid (SiO2) och diamantliknande kol (DLC). Även om CP-AFM-nanoindentation ofta är förstahandsvalet för karakterisering av mjuka prover, har det sina egna problem och begränsningar. Användningen av stora, mikronstora sfäriska spetsar ökar spetsens totala kontaktyta med provet och resulterar i en betydande förlust av rumslig upplösning. För mjuka, inhomogena prover, där de mekaniska egenskaperna hos lokala element kan skilja sig avsevärt från genomsnittet över ett större område, kan CP-indentation dölja eventuell inhomogenitet i egenskaper på lokal skala52. Kolloidala prober tillverkas vanligtvis genom att fästa mikronstora kolloidala sfärer på spetslösa utskjutande delar med hjälp av epoxilim. Själva tillverkningsprocessen är behäftad med många problem och kan leda till inkonsekvenser i sondkalibreringsprocessen. Dessutom påverkar storleken och massan av kolloidala partiklar direkt de viktigaste kalibreringsparametrarna för utskjutande prober, såsom resonansfrekvens, fjäderstyvhet och avböjningskänslighet56,57,58. Därför kanske vanligt förekommande metoder för konventionella AFM-prober, såsom temperaturkalibrering, inte ger en noggrann kalibrering för CP, och andra metoder kan krävas för att utföra dessa korrigeringar57, 59, 60, 61. Typiska CP-intryckningsexperiment använder utskjutande prober med stora avvikelser för att studera egenskaperna hos mjuka prover, vilket skapar ett annat problem vid kalibrering av utskjutande probers icke-linjära beteende vid relativt stora avvikelser62,63,64. Moderna kolloidala probintryckningsmetoder tar vanligtvis hänsyn till geometrin hos utskjutande prober som används för att kalibrera proben, men ignorerar inflytandet av kolloidala partiklar, vilket skapar ytterligare osäkerhet i metodens noggrannhet38,61. På liknande sätt är elasticitetsmoduler beräknade genom kontaktmodellanpassning direkt beroende av indentationssondens geometri, och avvikelser mellan spets- och provytans egenskaper kan leda till felaktigheter27, 65, 66, 67, 68. Några nya arbeten av Spencer et al. De faktorer som bör beaktas vid karakterisering av mjuka polymerborstar med CP-AFM-nanoindentationsmetoden framhävs. De rapporterade att retentionen av en viskös vätska i polymerborstar som en funktion av hastighet resulterar i en ökning av huvudbelastningen och därmed olika mätningar av hastighetsberoende egenskaper30,69,70,71.
I denna studie har vi karakteriserat ytmodulen hos det ultramjuka, högelastiska materialet lehfilcon A CL med hjälp av en modifierad AFM-nanoindenteringsmetod. Med tanke på materialets egenskaper och nya struktur är känslighetsomfånget för den traditionella indenteringsmetoden uppenbarligen otillräckligt för att karakterisera modulen hos detta extremt mjuka material, så det är nödvändigt att använda en AFM-nanoindenteringsmetod med högre och lägre känslighetsnivå. Efter att ha granskat bristerna och problemen med befintliga kolloidala AFM-prob-nanoindenteringstekniker visar vi varför vi valde en mindre, specialdesignad AFM-sond för att eliminera känslighet, bakgrundsbrus, precisera kontaktpunkter, mäta hastighetsmodulen hos mjuka heterogena material, såsom vätskeretentionsberoende, och noggrann kvantifiering. Dessutom kunde vi noggrant mäta formen och dimensionerna på indenteringsspetsen, vilket gjorde det möjligt för oss att använda kon-sfär-anpassningsmodellen för att bestämma elasticitetsmodulen utan att bedöma spetsens kontaktyta med materialet. De två implicita antagandena som kvantifieras i detta arbete är materialets helt elastiska egenskaper och den djupoberoende modulen för indenteringsdjup. Med hjälp av denna metod testade vi först ultramjuka standarder med en känd modul för att kvantifiera metoden, och använde sedan metoden för att karakterisera ytorna på två olika kontaktlinsmaterial. Denna metod för att karakterisera AFM-nanoindentationsytor med ökad känslighet förväntas vara tillämplig på ett brett spektrum av biomimetiska heterogena ultramjuka material med potentiell användning inom medicintekniska produkter och biomedicinska tillämpningar.
Lehfilcon A-kontaktlinser (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) och deras silikonhydrogelsubstrat valdes för nanoindentationsexperimenten. En specialdesignad linsfattning användes i experimentet. För att installera linsen för testning placerades den försiktigt på det kupolformade stativet, varvid inga luftbubblor kom in, och fixerades sedan med kanterna. Ett hål i fixturen högst upp på linshållaren ger åtkomst till linsens optiska centrum för nanoindentationsexperimenten samtidigt som vätskan hålls på plats. Detta håller linserna helt hydrerade. 500 μl kontaktlinsförpackningslösning användes som testlösning. För att verifiera de kvantitativa resultaten framställdes kommersiellt tillgängliga icke-aktiverade polyakrylamid (PAAM)-hydrogeler från en polyakrylamid-ko-metylen-bisakrylamidkomposition (100 mm Petrisoft Petri-skålar, Matrigen, Irvine, CA, USA), en känd elasticitetsmodul på 1 kPa. Använd 4–5 droppar (cirka 125 µl) fosfatbuffrad saltlösning (PBS från Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) och 1 droppe OPTI-FREE Puremoist kontaktlinslösning (Alcon, Vaud, TX, USA) vid gränssnittet mellan AFM-hydrogelen och proben.
Prover av Lehfilcon A CL- och SiHy-substrat visualiserades med hjälp av ett FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM)-system utrustat med en svepande transmissionselektronmikroskop (STEM)-detektor. För att förbereda proverna tvättades linserna först med vatten och skars i pajformade kilar. För att uppnå en differentiell kontrast mellan de hydrofila och hydrofoba komponenterna i proverna användes en 0,10 % stabiliserad lösning av RuO4 som färgämne, i vilken proverna nedsänktes i 30 minuter. Lehfilcon A CL RuO4-färgning är viktig inte bara för att uppnå förbättrad differentiell kontrast, utan hjälper också till att bevara strukturen hos de grenade polymerpenslarna i sin ursprungliga form, vilken sedan är synlig på STEM-bilder. De tvättades sedan och dehydrerades i en serie etanol/vatten-blandningar med ökande etanolkoncentration. Proverna göts sedan med EMBed 812/Araldite-epoxi, som härdades över natten vid 70 °C. Provblock erhållna genom hartspolymerisation skars med en ultramikrotom, och de resulterande tunna sektionerna visualiserades med en STEM-detektor i lågvakuumläge vid en accelerationsspänning på 30 kV. Samma SEM-system användes för detaljerad karakterisering av PFQNM-LC-A-CAL AFM-proben (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). SEM-bilder av AFM-proben erhölls i ett typiskt högvakuumläge med en accelerationsspänning på 30 kV. Bilder togs vid olika vinklar och förstoringsgrader för att registrera alla detaljer om formen och storleken på AFM-probens spets. Alla spetsdimensioner av intresse i bilderna mättes digitalt.
Ett atomkraftsmikroskop av typen Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) med läget "PeakForce QNM in Fluid" användes för att visualisera och nanoindentera lehfilcon A CL-, SiHy-substrat- och PAAm-hydrogelprover. För avbildningsexperimenten användes en PEAKFORCE-HIRS-FA-sond (Bruker) med en nominell spetsradie på 1 nm för att ta högupplösta bilder av provet med en skanningshastighet på 0,50 Hz. Alla bilder togs i vattenlösning.
AFM-nanoindenteringsexperiment utfördes med en PFQNM-LC-A-CAL-sond (Bruker). AFM-sonden har en kiselspets på en nitridkonsol som är 345 nm tjock, 54 µm lång och 4,5 µm bred med en resonansfrekvens på 45 kHz. Den är specifikt utformad för att karakterisera och utföra kvantitativa nanomekaniska mätningar på mjuka biologiska prover. Sensorerna kalibreras individuellt på fabriken med förkalibrerade fjäderinställningar. Fjäderkonstanterna för sonderna som användes i denna studie låg i intervallet 0,05–0,1 N/m. För att exakt bestämma spetsens form och storlek karakteriserades sonden i detalj med hjälp av SEM. I fig. 1a visas ett högupplöst, lågförstorande svepelektronmikrografi av PFQNM-LC-A-CAL-sonden, vilket ger en helhetsvy av sonddesignen. I fig. 1b visas en förstorad vy av toppen av sondspetsen, som ger information om spetsens form och storlek. I den extrema änden är nålen en halvsfär med en diameter på cirka 140 nm (Fig. 1c). Nedanför denna smalnar spetsen av till en konisk form och når en uppmätt längd på cirka 500 nm. Utanför det avsmalnande området är spetsen cylindrisk och slutar med en total spetslängd på 1,18 µm. Detta är den huvudsakliga funktionella delen av sondspetsen. Dessutom användes en stor sfärisk polystyren (PS) sond (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) med en spetsdiameter på 45 µm och en fjäderkonstant på 2 N/m för testning som en kolloidal sond, med PFQNM-LC-A-CAL 140 nm sond för jämförelse.
Det har rapporterats att vätska kan fastna mellan AFM-sonden och polymerborststrukturen under nanoindentering, vilket kommer att utöva en uppåtriktad kraft på AFM-sonden innan den faktiskt vidrör ytan69. Denna viskösa extruderingseffekt på grund av vätskeretention kan ändra den synbara kontaktpunkten och därigenom påverka ytmodulmätningarna. För att studera effekten av sondens geometri och intryckningshastighet på vätskeretention ritades intryckningskraftskurvor för lehfilcon A CL-prover med en sond med 140 nm diameter vid konstanta förskjutningshastigheter på 1 µm/s och 2 µm/s. Sonddiameter 45 µm, fast kraftinställning 6 nN uppnådd vid 1 µm/s. Experiment med en sond med 140 nm diameter utfördes med en intryckningshastighet på 1 µm/s och en inställd kraft på 300 pN, vald för att skapa ett kontakttryck inom det fysiologiska intervallet (1–8 kPa) för det övre ögonlocket. tryck 72. Mjuka, färdiga prover av PAA-hydrogel med ett tryck på 1 kPa testades för en intryckningskraft på 50 pN vid en hastighet av 1 μm/s med användning av en sond med en diameter på 140 nm.
Eftersom längden på den koniska delen av spetsen på PFQNM-LC-A-CAL-sonden är ungefär 500 nm, kan det för alla indentationsdjup < 500 nm säkert antas att sondens geometri under indentationen kommer att förbli trogen sin konform. Dessutom antas det att ytan på det testade materialet kommer att uppvisa en reversibel elastisk respons, vilket också kommer att bekräftas i följande avsnitt. Beroende på spetsens form och storlek valde vi därför kon-sfär-anpassningsmodellen utvecklad av Briscoe, Sebastian och Adams, som finns tillgänglig i leverantörens programvara, för att bearbeta våra AFM-nanoindentationsexperiment (NanoScope). Separationsdataanalysprogramvara, Bruker) 73. Modellen beskriver kraft-förskjutningsförhållandet F(δ) för en kon med en sfärisk apexdefekt. I fig. Figur 2 visar kontaktgeometrin under interaktionen mellan en stel kon och en sfärisk spets, där R är den sfäriska spetsens radie, a är kontaktradien, b är kontaktradien vid änden av den sfäriska spetsen, δ är kontaktradien. Intryckningsdjupet, θ är konens halva vinkel. SEM-bilden av denna prob visar tydligt att den sfäriska spetsen med en diameter på 140 nm övergår tangentiellt i en kon, så här definieras b endast genom R, dvs. b = R cos θ. Den leverantörslevererade programvaran tillhandahåller ett kon-sfär-förhållande för att beräkna Youngs modul (E)-värden från kraftseparationsdata under antagandet att a > b. Förhållande:
där F är intryckningskraften, E är elasticitetsmodulen och ν är Poissons förhållande. Kontaktradien a kan uppskattas med hjälp av:
Schema över kontaktgeometrin för en stel kon med en sfärisk spets pressad in i materialet i en Lefilcon-kontaktlins med ett ytskikt av grenade polymerborstar.
Om a ≤ b, reduceras relationen till ekvationen för en konventionell sfärisk indentor;
Vi tror att interaktionen mellan indenteringssonden och den grenade strukturen hos PMPC-polymerborsten kommer att göra att kontaktradien a blir större än den sfäriska kontaktradien b. Därför använde vi, för alla kvantitativa mätningar av elasticitetsmodulen som utfördes i denna studie, det beroende som erhölls för fallet a > b.
De ultramjuka biomimetiska materialen som studerades i denna studie avbildades omfattande med hjälp av svepande transmissionselektronmikroskopi (STEM) av provets tvärsnitt och atomkraftsmikroskopi (AFM) av ytan. Denna detaljerade ytkarakterisering utfördes som en utvidgning av vårt tidigare publicerade arbete, där vi fastställde att den dynamiskt grenade polymera borststrukturen hos den PMPC-modifierade lehfilcon A CL-ytan uppvisade liknande mekaniska egenskaper som nativ hornhinnevävnad 14. Av denna anledning hänvisar vi till kontaktlinsytor som biomimetiska material 14. I figur 3a och 3b visas tvärsnitt av grenade PMPC-polymerborststrukturer på ytan av ett lehfilcon A CL-substrat respektive ett obehandlat SiHy-substrat. Ytorna på båda proverna analyserades vidare med högupplösta AFM-bilder, vilket ytterligare bekräftade resultaten av STEM-analysen (figur 3c och 3d). Sammantaget ger dessa bilder en ungefärlig längd av den grenade PMPC-polymerborststrukturen vid 300–400 nm, vilket är avgörande för att tolka AFM-nanoindentationsmätningar. En annan viktig observation som härletts från bilderna är att den övergripande ytstrukturen hos det biomimetiska CL-materialet morfologiskt skiljer sig från den hos SiHy-substratmaterialet. Denna skillnad i deras ytmorfologi kan bli tydlig under deras mekaniska interaktion med den intryckta AFM-proben och därefter i de uppmätta modulvärdena.
Tvärsnitts-STEM-bilder av (a) lehfilcon A CL och (b) SiHy-substrat. Skalstreck, 500 nm. AFM-bilder av ytan av lehfilcon A CL-substratet (c) och bas-SiHy-substratet (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirerade polymerer och polymerborststrukturer är i sig mjuka och har studerats och använts i stor utsträckning i olika biomedicinska tillämpningar74,75,76,77. Därför är det viktigt att använda AFM-nanoindentationsmetoden, som kan mäta deras mekaniska egenskaper noggrant och tillförlitligt. Men samtidigt gör de unika egenskaperna hos dessa ultramjuka material, såsom extremt låg elasticitetsmodul, hög vätskehalt och hög elasticitet, det ofta svårt att välja rätt material, form och storlek på indenteringssonden. Detta är viktigt så att indentern inte tränger igenom provets mjuka yta, vilket skulle leda till fel vid bestämning av kontaktpunkten med ytan och kontaktytan.
För detta är en omfattande förståelse av morfologin hos ultramjuka biomimetiska material (lehfilcon A CL) avgörande. Information om storleken och strukturen hos de grenade polymerborstarna som erhållits med avbildningsmetoden utgör grunden för den mekaniska karakteriseringen av ytan med hjälp av AFM-nanoindentationstekniker. Istället för sfäriska kolloidala sonder i mikronstorlek valde vi PFQNM-LC-A-CAL kiselnitridsonden (Bruker) med en spetsdiameter på 140 nm, speciellt utformad för kvantitativ kartläggning av de mekaniska egenskaperna hos biologiska prover 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Motiveringen för att använda relativt vassa sonder jämfört med konventionella kolloidala sonder kan förklaras av materialets strukturella egenskaper. Om man jämför sondspetsens storlek (~140 nm) med de grenade polymerborstarna på ytan av CL lehfilcon A, som visas i figur 3a, kan man dra slutsatsen att spetsen är tillräckligt stor för att komma i direkt kontakt med dessa borststrukturer, vilket minskar risken för att spetsen tränger igenom dem. För att illustrera denna punkt visas i figur 4 en STEM-bild av lehfilcon A CL och den indragna spetsen på AFM-sonden (ritad i skala).
Schematisk bild som visar STEM-bild av lehfilcon A CL och en ACM-intrycksprob (ritad i skala).
Dessutom är spetsstorleken på 140 nm tillräckligt liten för att undvika risken för de klibbiga extruderingseffekter som tidigare rapporterats för polymerborstar producerade med CP-AFM-nanoindenteringsmetoden69,71. Vi antar att på grund av den speciella konsfäriska formen och den relativt lilla storleken på denna AFM-spets (Fig. 1), kommer karaktären hos den kraftkurva som genereras av lehfilcon A CL-nanoindentationen inte att bero på intryckningshastigheten eller laddnings-/lossningshastigheten. Därför påverkas den inte av poroelastiska effekter. För att testa denna hypotes indenterades lehfilcon A CL-prover med en fast maximal kraft med hjälp av en PFQNM-LC-A-CAL-sond, men med två olika hastigheter, och de resulterande drag- och returkraftkurvorna användes för att plotta kraften (nN) i separation (µm) som visas i figur 5a. Det är tydligt att kraftkurvorna under belastning och lossning överlappar varandra helt, och det finns inga tydliga bevis för att kraftskjuvningen vid noll indentationsdjup ökar med indentationshastigheten i figuren, vilket tyder på att de enskilda borstelementen karakteriserades utan en poroelastisk effekt. Däremot är vätskeretentionseffekter (viskös extrudering och poroelasticitetseffekter) tydliga för AFM-proben med 45 µm diameter vid samma indentationshastighet och framhävs av hysteresen mellan sträck- och returkurvorna, såsom visas i figur 5b. Dessa resultat stöder hypotesen och antyder att prober med 140 nm diameter är ett bra val för att karakterisera sådana mjuka ytor.
lehfilcon A CL-indryckningskraftskurvor med ACM; (a) med en sond med en diameter på 140 nm vid två belastningshastigheter, vilket visar avsaknaden av en poroelastisk effekt under ytintryckning; (b) med sonder med en diameter på 45 µm och 140 nm. s visar effekterna av viskös extrudering och poroelasticitet för stora sonder jämfört med mindre sonder.
För att karakterisera ultramjuka ytor måste AFM-nanoindentationsmetoder ha den bästa sonden för att studera egenskaperna hos det studerade materialet. Förutom spetsform och storlek spelar AFM-detektorsystemets känslighet, känsligheten för spetsavböjning i testmiljön och utkragningsstyvheten en viktig roll för att bestämma noggrannheten och tillförlitligheten hos nanoindentationsmätningarna. För vårt AFM-system är PSD-detektionsgränsen (Position Sensitive Detector) ungefär 0,5 mV och baseras på den förkalibrerade fjäderkonstanten och den beräknade vätskeavböjningskänsligheten för PFQNM-LC-A-CAL-sonden, vilket motsvarar den teoretiska belastningskänsligheten. är mindre än 0,1 pN. Därför möjliggör denna metod mätning av en minsta indentationskraft ≤ 0,1 pN utan någon perifer bruskomponent. Det är dock nästan omöjligt för ett AFM-system att reducera perifert brus till denna nivå på grund av faktorer som mekanisk vibration och vätskedynamik. Dessa faktorer begränsar den totala känsligheten för AFM-nanoindenteringsmetoden och resulterar också i en bakgrundsbrussignal på ungefär ≤ 10 pN. För ytkarakterisering indenterades lehfilcon A CL- och SiHy-substratprover under helt hydratiserade förhållanden med hjälp av en 140 nm-sond för SEM-karakterisering, och de resulterande kraftkurvorna överlagrades mellan kraft (pN) och tryck. Separationsdiagrammet (µm) visas i figur 6a. Jämfört med SiHy-bassubstratet visar lehfilcon A CL-kraftkurvan tydligt en övergångsfas som börjar vid kontaktpunkten med den gaffelformade polymerborsten och slutar med en skarp förändring i lutningen som markerar spetsens kontakt med det underliggande materialet. Denna övergångsdel av kraftkurvan belyser det verkligt elastiska beteendet hos den grenade polymerborsten på ytan, vilket framgår av kompressionskurvan som noggrant följer spänningskurvan och kontrasten i mekaniska egenskaper mellan borststrukturen och det skrymmande SiHy-materialet. Vid jämförelse av lefilcon. Separationen av den genomsnittliga längden på en grenad polymerborste i STEM-bilden av PCS (fig. 3a) och dess kraftkurva längs abscissan i fig. 3a. 6a visar att metoden kan detektera spetsen och den grenade polymeren som når den allra högsta toppen av ytan. Kontakt mellan borststrukturerna. Dessutom indikerar nära överlappning av kraftkurvorna ingen vätskeretentionseffekt. I detta fall finns det absolut ingen vidhäftning mellan nålen och provytan. De översta delarna av kraftkurvorna för de två proverna överlappar varandra, vilket återspeglar likheten i substratmaterialens mekaniska egenskaper.
(a) AFM-nanoindentationskraftkurvor för lehfilcon A CL-substrat och SiHy-substrat, (b) kraftkurvor som visar kontaktpunktsuppskattning med hjälp av bakgrundsbrusgränsmetoden.
För att studera de finare detaljerna i kraftkurvan ritas spänningskurvan för lehfilcon A CL-provet om i figur 6b med en maximal kraft på 50 pN längs y-axeln. Denna graf ger viktig information om det ursprungliga bakgrundsbruset. Bruset ligger i intervallet ±10 pN, vilket används för att exakt bestämma kontaktpunkten och beräkna indentationsdjupet. Som rapporterats i litteraturen är identifiering av kontaktpunkter avgörande för att korrekt bedöma materialegenskaper såsom modul85. En metod som involverar automatisk bearbetning av kraftkurvdata har visat en förbättrad anpassning mellan dataanpassning och kvantitativa mätningar för mjuka material86. I detta arbete är vårt val av kontaktpunkter relativt enkelt och objektivt, men det har sina begränsningar. Vår konservativa metod för att bestämma kontaktpunkten kan resultera i något överskattade modulvärden för mindre indentationsdjup (< 100 nm). Användningen av algoritmbaserad kontaktpunktsdetektering och automatiserad databehandling skulle kunna vara en fortsättning på detta arbete i framtiden för att ytterligare förbättra vår metod. För inneboende bakgrundsbrus i storleksordningen ±10 pN definierar vi således kontaktpunkten som den första datapunkten på x-axeln i figur 6b med ett värde på ≥10 pN. Sedan, i enlighet med bruströskeln på 10 pN, markerar en vertikal linje på nivån ~0,27 µm kontaktpunkten med ytan, varefter sträckningskurvan fortsätter tills substratet når intryckningsdjupet på ~270 nm. Intressant nog, baserat på storleken på de grenade polymerborststrukturerna (300–400 nm) mätta med avbildningsmetoden, är intryckningsdjupet för CL lehfilcon A-provet som observerats med bakgrundsbrusgränsmetoden cirka 270 nm, vilket är mycket nära mätstorleken med STEM. Dessa resultat bekräftar ytterligare kompatibiliteten och tillämpbarheten av formen och storleken på AFM-sondspetsen för intryckning av denna mycket mjuka och mycket elastiska grenade polymerborststruktur. Dessa data ger också starka bevis för att stödja vår metod att använda bakgrundsbrus som ett tröskelvärde för att lokalisera kontaktpunkter. Således bör alla kvantitativa resultat som erhålls från matematisk modellering och kraftkurvanpassning vara relativt noggranna.
Kvantitativa mätningar med AFM-nanoindentationsmetoder är helt beroende av de matematiska modeller som används för dataval och efterföljande analys. Därför är det viktigt att beakta alla faktorer relaterade till valet av indenter, materialegenskaper och mekaniken i deras interaktion innan man väljer en viss modell. I detta fall karakteriserades spetsgeometrin noggrant med hjälp av SEM-mikrografer (Fig. 1), och baserat på resultaten är AFM-nanoindentationssonden med en diameter på 140 nm, en hård kon och sfärisk spetsgeometri ett bra val för att karakterisera lehfilcon A CL79-prover. En annan viktig faktor som måste utvärderas noggrant är elasticiteten hos det polymermaterial som testas. Även om de initiala data för nanoindentation (Fig. 5a och 6a) tydligt beskriver egenskaperna hos överlappningen av spännings- och kompressionskurvorna, dvs. materialets fullständiga elastiska återhämtning, är det extremt viktigt att bekräfta kontakternas rent elastiska natur. För detta ändamål utfördes två på varandra följande indentationer på samma plats på ytan av lehfilcon A CL-provet med en indentationshastighet på 1 µm/s under fullständiga hydreringsförhållanden. De resulterande kraftkurvorna visas i figur 7 och, som förväntat, är expansions- och kompressionskurvorna för de två trycken nästan identiska, vilket framhäver den höga elasticiteten hos den grenade polymerborststrukturen.
Två indentationskraftskurvor på samma plats på ytan av lehfilcon A CL indikerar linsytans ideala elasticitet.
Baserat på information erhållen från SEM- och STEM-bilder av probspetsen respektive lehfilcon A CL-ytan, är kon-sfärmodellen en rimlig matematisk representation av interaktionen mellan AFM-probspetsen och det mjuka polymermaterialet som testas. Dessutom gäller för denna kon-sfärmodell de grundläggande antagandena om det präglade materialets elastiska egenskaper för detta nya biomimetiska material och används för att kvantifiera elasticitetsmodulen.
Efter en omfattande utvärdering av AFM-nanoindentationsmetoden och dess komponenter, inklusive indentationssondens egenskaper (form, storlek och fjäderstyvhet), känslighet (bakgrundsbrus och kontaktpunktsuppskattning) och dataanpassningsmodeller (kvantitativa modulmätningar), användes metoden för att karakterisera kommersiellt tillgängliga ultramjuka prover för att verifiera kvantitativa resultat. En kommersiell polyakrylamid (PAAM) hydrogel med en elasticitetsmodul på 1 kPa testades under hydratiserade förhållanden med en 140 nm sond. Detaljer om modultestning och beräkningar finns i den kompletterande informationen. Resultaten visade att den genomsnittliga uppmätta modulen var 0,92 kPa, och %RSD och procentuell (%) avvikelse från den kända modulen var mindre än 10 %. Dessa resultat bekräftar noggrannheten och reproducerbarheten hos AFM-nanoindentationsmetoden som används i detta arbete för att mäta modulerna hos ultramjuka material. Ytorna på lehfilcon A CL-proverna och SiHy-bassubstratet karakteriserades vidare med samma AFM-nanoindentationsmetod för att studera den synbara kontaktmodulen för den ultramjuka ytan som en funktion av indentationsdjupet. Indentationskraftseparationskurvor genererades för tre prover av varje typ (n = 3; en intryckning per prov) vid en kraft på 300 pN, en hastighet på 1 µm/s och full hydrering. Indentationskraftdelningskurvan approximerades med hjälp av en kon-sfärmodell. För att erhålla en modul beroende på intryckningsdjupet sattes en 40 nm bred del av kraftkurvan vid varje steg på 20 nm med början från kontaktpunkten, och värden för modulen mättes vid varje steg på kraftkurvan. Spin Cy et al. En liknande metod har använts för att karakterisera modulgradienten för poly(laurylmetakrylat) (P12MA) polymerborstar med användning av kolloidal AFM-sond-nanoindentation, och de överensstämmer med data som använder Hertz-kontaktmodellen. Denna metod ger ett diagram över den skenbara kontaktmodulen (kPa) kontra intryckningsdjupet (nm), såsom visas i figur 8, vilket illustrerar den skenbara kontaktmodulen/djupgradienten. Den beräknade elasticitetsmodulen för CL lehfilcon A-provet ligger i intervallet 2–3 kPa inom de övre 100 nm av provet, bortom vilka den börjar öka med djupet. Å andra sidan, när man testar SiHy-bassubstratet utan en borstliknande film på ytan, är det maximala intryckningsdjupet som uppnås vid en kraft på 300 pN mindre än 50 nm, och modulvärdet som erhålls från data är cirka 400 kPa, vilket är jämförbart med värdena för Youngs modul för bulkmaterial.
Skenbar kontaktmodul (kPa) kontra indentationsdjup (nm) för lehfilcon A CL- och SiHy-substrat med AFM-nanoindentationsmetod med kon-sfärgeometri för att mäta modulen.
Den översta ytan av den nya biomimetiska grenade polymerborststrukturen uppvisar en extremt låg elasticitetsmodul (2–3 kPa). Detta kommer att matcha den fritt hängande änden av den gaffelformade polymerborsten, såsom visas i STEM-bilden. Även om det finns vissa tecken på en modulgradient vid CL:s ytterkant, är det huvudsakliga substratet med hög modul mer inflytelserikt. De översta 100 nm av ytan ligger dock inom 20 % av den grenade polymerborstens totala längd, så det är rimligt att anta att de uppmätta värdena för modulen i detta indentationsdjupområde är relativt noggranna och inte starkt beroende av effekten av det nedre objektet.
På grund av den unika biomimetiska designen hos lehfilcon A-kontaktlinser, bestående av grenade PMPC-polymerborststrukturer ympade på ytan av SiHy-substrat, är det mycket svårt att tillförlitligt karakterisera de mekaniska egenskaperna hos deras ytstrukturer med traditionella mätmetoder. Här presenterar vi en avancerad AFM-nanoindentationsmetod för att noggrant karakterisera ultramjuka material som lefilcon A med hög vattenhalt och extremt hög elasticitet. Denna metod är baserad på användningen av en AFM-sond vars spetsstorlek och geometri är noggrant utvalda för att matcha de strukturella dimensionerna hos de ultramjuka ytegenskaper som ska präglas. Denna kombination av dimensioner mellan sond och struktur ger ökad känslighet, vilket gör att vi kan mäta den låga modulen och de inneboende elasticitetsegenskaperna hos grenade polymerborstelement, oavsett poroelastiska effekter. Resultaten visade att de unika grenade PMPC-polymerborstarna som är karakteristiska för linsytan hade en extremt låg elasticitetsmodul (upp till 2 kPa) och mycket hög elasticitet (nästan 100 %) vid testning i en vattenhaltig miljö. Resultaten från AFM-nanoindenteringen gjorde det också möjligt för oss att karakterisera den skenbara kontaktmodulen/djupgradienten (30 kPa/200 nm) för den biomimetiska linsytan. Denna gradient kan bero på modulskillnaden mellan de grenade polymerborstarna och SiHy-substratet, eller den grenade strukturen/densiteten hos polymerborstarna, eller en kombination därav. Ytterligare djupgående studier behövs dock för att fullt ut förstå sambandet mellan struktur och egenskaper, särskilt effekten av borstförgrening på mekaniska egenskaper. Liknande mätningar kan hjälpa till att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos ytan på andra ultramjuka material och medicintekniska produkter.
Dataset som genererats och/eller analyserats under den aktuella studien är tillgängliga från respektive författare på rimlig begäran.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. och Haugen, HJ Biologiska reaktioner på fysikaliska och kemiska egenskaper hos ytor av biomaterial. Chemical. society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM och Liu, X. Förbättring av biomaterial från människor för vävnadsteknik. programmering. polymer. vetenskapen. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Design, klinisk implementering och immunsvar av biomaterial inom regenerativ medicin. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK och Farr GM En förbättrad metod för att bestämma hårdhet och elasticitetsmodul med hjälp av intryckningsexperiment med last- och förskjutningsmätningar. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM. Historiska ursprung för indentationshårdhetsprovning. Alma Mater. Science. Technologies. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Mätningar av intryckningshårdhet på makro-, mikro- och nanoskala: En kritisk granskning. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD och Clapperich, SM Ytdetekteringsfel leder till överskattning av modulus vid nanoindentation av mjuka material. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR och Yahya M.Yu. Utvärdering av nanoindentationsmetoden för att bestämma de mekaniska egenskaperna hos heterogena nanokompositer med hjälp av experimentella och beräkningsmetoder. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, och Owart, TS Mekanisk karakterisering av mjuka viskoelastiska geler genom indentation och optimeringsbaserad invers finita elementanalys. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J och Chaneler D. Optimering av viskoelasticitetsbestämning med kompatibla mätsystem. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. och Pellillo, E. Nanoindentation av polymera ytor. J. Physics. D. Apply for Physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. och Van Vliet KJ Karakterisering av viskoelastiska mekaniska egenskaper hos högelastiska polymerer och biologiska vävnader med hjälp av stötdämpande intryckning. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Utvärdering av elasticitetsmodulen och vidhäftningsarbetet hos mjuka material med hjälp av den utökade Borodich-Galanov (BG)-metoden och djup indentation. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Nanoskalig morfologi och mekaniska egenskaper hos biomimetiska polymerytor av silikonhydrogelkontaktlinser. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).